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浮游微藻在AVNV流行传播中的作用分析

作　者: 张婧宇
导　师: 李赟
学　校: 中国海洋大学
专　业: 动物学
关键词: 微藻 AVNV 栉孔扇贝病毒水平传播途径
分类号: S944.43
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

栉孔扇贝(Chlamys farreri)是我国北方沿海重要的养殖贝类。由于大规模死亡病害的频繁发作,栉孔扇贝养殖业遭受了严重打击。已有研究表明,栉孔扇贝急性病毒性坏死症病毒(Acute Viral Necrosis Virus, AVNV)是其直接病原。现已成功建立了包括免疫学及分子学在内的多种病原检测技术,这些工作为了解扇贝饵料生物携带AVNV及认识AVNV的流行传播规律奠定了基础。为了解常见微藻黏附携带AVNV的情况,本论文从发病扇贝组织提取AVNV粗提液作为病料,感染17种常见微藻培养物。在感染不同时间取样,提取DNA,利用PCR、FQ-PCR和LAMP等分子检测技术进行病原检测结果显示,有6种微藻可在2-9天内携带大于107拷贝/L的AVNV,这6种微藻分别是亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)、小球藻(Chlorella sp.)、四爿藻(Tetraselmis tetrathele)、绿色杜氏藻(Dunaliella viridis)、小新月菱形藻(Nitzschia sp.)和中肋骨条藻(Skeletonema costatum)。本研究同时用少量携带AVNV的微藻作为感染材料与AVNV检测阴性的微藻混合培养,结果表明AVNV并不能在微藻细胞内进行增殖,这说明微藻可能仅能简单粘附AVNV而并非其中间宿主。为明确微藻-AVNV复合体对栉孔扇贝的致病力,本研究以6种携带AVNV的微藻配合混合的无毒微藻培养液投喂栉孔扇贝。观察、统计试验扇贝的死亡情况,并对试验扇贝的病毒感染率及感染强度进行了定量检测。结果表明,小球藻实验组和四爿藻组的扇贝在第2天出现死亡,小新月菱形藻组和绿色杜氏藻实验组死亡发生在第3天,亚心形扁藻和中肋骨条藻实验组则在攻毒后第4天开始死亡。亚心形扁藻实验组在感染后的第4天,中肋骨条藻组在第6天,绿色杜氏藻组、小球藻组、四爿藻实验组和小新月菱形藻组均在第7天进入快速死亡期。至第九天试验结束时,亚心形扁藻组、四爿藻组、小球藻组、绿色杜氏藻组、小新月菱形藻组和中肋骨条藻组的累积死亡率分别为76.47%、88.23%、86.27%、86.27%、78.43%和82.35%,均与对照组(17.65%)有极显著差异(p<0.01)。对感染组病原进行LAMP检测显示,亚心形扁藻实验组的病毒感染率最高,为72.97%。感染率最低的为小新月菱形藻攻毒组,为55.56%,6个攻毒组扇贝的感染率均与对照组(15.38%)有显著或极显著差异。FQ-PCR复检结果表明,绿色杜氏藻和小新月菱形藻的病毒感染强度分别为7.54×106和1.82×106拷贝/克鳃组织,与对照组(7.5×104拷贝／克鳃组织)显著差异(p<0.05),亚心形扁藻、四爿藻、小球藻和中肋骨条藻的感染强度分别为1.46×107、4.04×106、4.42×106和2.72×106拷贝/克鳃组织与对照组有极显著差异(p<0.01)。相关性分析表明,扇贝的累积死亡率与病毒感染率之间有极显著相关性(93.1%,p<0.01),与扇贝病毒感染强度之间仅有不强的相关性(38.5%),而扇贝的感染率和扇贝的病毒感染强度之间则有较大的相关性(63.8%)。微藻-AVNV复合体所携带的病毒载量与扇贝的感染率及感染强度有较明显的相关性,相关性系数为分别为0.637和0.721。但与扇贝的累积死亡率并没有很大的相关性,相关性仅为33.9%。综合本实验的结果,AVNV病毒粒子可以在一定时期内粘附到常见微藻上,栉孔扇贝通过接触、摄食可感染AVNV,并发病,最终导致死亡。这说明浮游微藻是AVNV水平传播途径中的重要介导体。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
0 前言  12-21
  0.1 中国北方海区养殖栉孔扇贝发病情况及病毒的特点  12-14
  0.2 AVNV诊断技术及研究进展  14-18
  0.3 AVND流行病学研究进展  18-19
  0.4 本论文的主要内容及目的意义  19-21
1 AVNV对藻类的选择粘附性  21-32
  1.1 实验材料  21-22
    1.1.1 微藻  21-22
    1.1.2 病毒粗提液的制备  22
  1.2 分子检测方法  22-24
    1.2.1 DNA制备  22-23
    1.2.2 PCR检测法  23
    1.2.3 荧光定量PCR检测法  23-24
  1.3 病毒感染微藻实验  24-25
  1.4 AVNV病毒在藻之间的平行传播实验  25
  1.5 结果和分析  25-29
    1.5.1 微藻选择性携带AVNV的实验  25-29
    1.5.2 AVNV在藻间的平行传播  29
  1.6 讨论  29-31
    1.6.2 浮游微藻携带AVNV的研究  29-31
  1.7 小结  31-32
2 微藻携带AVNV致病力实验  32-49
  2.1 材料和方法  33-36
    2.1.1 栉孔扇贝  33
    2.1.2 病毒粗体液提取  33
    2.1.3 带毒微藻的制备  33
    2.1.4 栉孔扇贝的人工感染  33-34
    2.1.5 扇贝组织中AVNV的分子检测法  34-36
    2.1.6 数据处理  36
  2.2 结果和分析  36-42
    2.2.1 栉孔扇贝感染病毒后的病理变化  36-38
    2.2.2 栉孔扇贝投喂携带AVNV微藻后发病死亡情况  38-39
    2.2.3 栉孔扇贝投喂携带AVNV微藻后病毒感染敏感器官  39
    2.2.4 栉孔扇贝感染实验扇贝病毒感染率  39-40
    2.2.5 栉孔扇贝投喂携带AVNV微藻后病毒感染强度  40-41
    2.2.6 实验扇贝累积死亡率、感染率和感染强度的相关性分析  41-42
  2.3 讨论  42-48
    2.3.1 关于三种分子检测方法的比较  42-44
    2.3.2 微藻携带的AVNV对栉孔扇贝的致病力  44-48
  2.4 小结  48-49
结论  49-50
附录1 实验溶液配方  50-52
附录2 微藻携带AVNV致病力分析数据  52-54
参考文献  54-59
致谢  59-60
个人简历  60
发表的学术论文  60

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