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模板细乳液聚合法制备磁性复合微球及其在蛋白分离纯化中的应用

作　者: 龚涛
导　师: 汪长春
学　校: 复旦大学
专　业: 高分子化学与物理
关键词: 磁性纳米粒子化学沉淀法苯乙烯模板细乳液聚合高磁含量单分散性磁性复合微球甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA) 种子乳液聚合核壳结构亚氨基二乙酸(IDA) 螯合蛋白纯化 SDS-PAGE凝胶电泳
分类号: TB383.1
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

近年来,有机-无机杂化复合微球,尤其是磁性复合微球正受到人们的广泛关注。由于磁性高分子微球同时具有无机磁性材料的磁响应性和有机高分子的表面功能性,在外加磁场下能方便、快速、高效的从介质中分离目标生物分子。因此,在生物医学和生物化学等领域显示广泛的应用前景。从诊断学的角度考虑,理想的磁性微球应具有均一的粒子尺寸、高的磁含量（快速的磁响应性）、功能化的表面。然而,现有制备磁性复合微球的方法要么破坏了磁性微球的单分散性,要么制备单分散的高磁含量的磁性微球的过程太复杂。并且,所制备的磁性分离载体存在吸附容量较低,偶联效率不高等问题。针对以上问题,本论文系统的围绕着磁性复合微球的制备、表面功能化修饰及其在蛋白分离纯化中的应用研究展开,主要取得了以下几个方面的结果:1)通过磁性模板细乳液聚合法制备粒径单分散的、磁含量可控的磁性复合微球Fe₃O₄@Poly（St/DVB）,整个制备过程操作简单、容易放大,具有工业化应用前景。首先,通过超声乳化构造粒径均匀的磁性模板（磁性纳米粒子簇）,然后将单体St和交联剂DVB加入到反应体系使之溶胀聚合,通过动态光散射（DLS）的结果表明单体聚合的主要场所在磁性模板细乳液中,聚合机理是细乳液聚合主导的模板细乳液聚合。所制备的磁性复合微球的尺寸有一个合理的均匀分布。DLS的表征结果表明:改变乳化剂的量,可以得到粒径在70-130 nm范围内的磁性复合微球。通过调节磁性模板细乳液与单体的比例,可以有效调节磁性复合微球磁含量于40-70 wt%之间。通过研究St/DVB的比率、乳化剂的量、助稳定剂、超声功率、引发剂类型、磁流体固含量、磁流体与单体的投料比等实验参数对磁性复合微球性能的影响,得到制备磁性复合微球的最佳配方。制备得到的磁性复合微球具有超顺磁性,可以作为优良的磁性载体而用于生物医学领域。此外,所提出的模板细乳液聚合法不仅能用于制备高磁含量、单分散的磁性复合微球,而且可以作为其它的高包封率的无机-有机杂化微球的制备方法。2)以磁性Fe₃O₄@Poly（St/DVB）复合微球为种子,通过种子乳液聚合制备得到表面富含环氧功能基团的核壳式磁性Fe₃O₄/Poly（St/DVB）@Poly（GMA/DVB）复合微球。TEM电镜的结果表明得到的核壳式磁性复合微球的粒径分布很均一。通过加入不同量的壳层单体,核壳式磁性复合微球的磁含量可控于23-43 wt%之间。硫代硫酸钠法滴定核壳式磁性复合微球表面的环氧基为0.126-0.190 mmol/g。通过亚氨基二乙酸（IDA）与磁性复合微球表面的环氧基团开环反应,在磁性复合微球表面引入IDA金属离子螯合基团,制备得到能螯合金属离子的磁性亲和分离载体。原子吸收光谱（AAS）和通过紫外光谱（UV）的分析结果表明磁性复合载体螯合Cu²⁺的能力分别为0.068-0.072 mmol/g和0.091-0.110 mmol/g。3)将核壳式磁性分离载体Fe₃O₄/Poly（St-DVB）@Poly（GMA-DVB）-IDA-Ni²⁺应用于S-腺苷甲硫氨酸合成酶（SAMS）的分离提纯。在外加磁场下作用下,磁性载体可以方便、迅速的纯化SAMS。通过详细研究反应介质初始SAMS蛋白浓度、咪唑洗脱液浓度、反应介质离子强度（NaCl浓度）、pH值、螯合金属离子种类等纯化条件对蛋白分离纯化的影响,从而得到磁性微球纯化SAMS蛋白的最佳分离条件。最后,在最佳分离条件下纯化不同初始浓度的SAMS蛋白,结果表明当初始蛋白浓度为3.0 mg/mL时,蛋白纯化量最大为50.0 mg/g,SDS-PAGE电泳结果显示所纯化的蛋白纯度很高,没有杂蛋白。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-13
第一章绪论  13-55
  1.1 引言  13
  1.2 细乳液聚合  13-19
    1.2.1 细乳液的组成及制备  14-15
      1.2.1.1 细乳液的组成  14-15
      1.2.1.2 细乳液的制备  15
    1.2.2 细乳液聚合机理  15-17
    1.2.3 细乳液制备在有机-无机杂化复合微球制备中的应用  17-19
  1.3 磁性聚合物复合微球的研究进展  19-30
    1.3.1 磁性纳米粒子的制备  19-21
      1.3.1.1 共沉淀法  19-20
      1.3.1.2 热分解法  20
      1.3.1.3 水热合成法  20-21
      1.3.1.4 微乳液法  21
    1.3.2 磁性复合微球的制备  21-30
      1.3.2.1 磁性复合微球的结构特点  21-22
      1.3.2.2 磁性复合微球的制备方法  22-30
        1.3.2.2.1 包埋法  22-23
        1.3.2.2.2 原位法  23
        1.3.2.2.3 单体聚合法  23-29
        1.3.2.2.4 ATRP法  29-30
        1.3.2.2.5 界面沉积法  30
  1.4 磁性微球载体的表面功能化及配基固定化  30-32
    1.4.1 表面功能化  30-31
    1.4.2 配基固定化  31-32
  1.5 磁性复合微球的应用  32-37
    1.5.1 靶向药物  32-33
    1.5.2 细胞分离  33-34
    1.5.3 核酸分离  34
    1.5.4 固定化酶  34-35
    1.5.5 蛋白分离  35-36
    1.5.6 其它应用  36-37
  1.6 本论文的选题和设计思路  37-39
  参考文献  39-55
第二章磁性模板细乳液聚合法制备磁性复合微球  55-85
  2.1 引言  55-57
  2.2 实验部分  57-59
    2.2.1 原料  57
    2.2.2 制备油酸稳定的四氧化三铁纳米粒子  57-58
    2.2.3 制备磁性模板细乳液及磁性Fe_3O_4@Poly(St-DVB)复合微球  58
    2.2.4 样品表征与测试  58-59
  2.3 结果与讨论  59-78
    2.3.1 制备油酸稳定的四氧化三铁纳米粒子  59-61
    2.3.2 磁性模板的制备及磁性复合微球的制备机理  61-64
    2.3.3 磁性模板细乳液聚合制备磁性复合微球  64-65
    2.3.4 实验参数对磁性复合微球性能的影响  65-76
      2.3.4.1 不同St/DVB的比率的影响  65-68
      2.3.4.2 不同乳化剂的量的影响  68-71
      2.3.4.3 疏水剂(助稳定剂)的影响  71-72
      2.3.4.4 不同超声功率的影响  72-73
      2.3.4.5 不同引发剂的影响  73
      2.3.4.6 磁流体固含量的影响  73-74
      2.3.4.7 磁性模板细乳液(磁流体)与单体的投料比的影响  74-76
    2.3.5 单分散磁性复合微球的制备  76-77
    2.3.6 磁性复合微球的磁性能  77-78
  2.4 本章小结  78-80
  参考文献  80-85
第三章核壳式磁性复合微球的制备及其表面功能化  85-107
  3.1 引言  85-87
  3.2 实验部分  87-89
    3.2.1 原料  87
    3.2.2 磁性模板细乳液法制备磁性Fe_3O_4@Poly(St-DVB)复合微球  87
    3.2.3 核壳式Fe_3O_4/Poly(St/DVB)@Poly(GMA/DVB)复合微球的制备  87-88
    3.2.4 制备亚氨基二乙酸(IDA)改性的磁性复合微球  88
    3.2.5 金属离子(Cu~(2+))的螯合  88
    3.2.6 样品的表征与测试  88-89
  3.3 结果与讨论  89-102
    3.3.1 磁性模板细乳液法制备磁性Fe_3O_4@Poly(St-DVB)复合微球  89-92
    3.3.2 核壳式Fe_3O_4/Poly(St-DVB)@Poly(GMA-DVB)复合微球的制备  92-97
    3.3.3 核壳式Fe_3O_4/Poly(St-DVB)@Poly(GMA-DVB)微球的磁性能  97-98
    3.3.4 核壳式磁性复合微球表面环氧基团的滴定  98-99
    3.3.5 亚氨基二乙酸(IDA)改性的磁性复合微球  99-102
      3.3.5.1 实验步骤  100
      3.3.5.2 原子吸收光谱(AAS)的表征  100-101
      3.3.5.3 紫外吸收光谱(UV)的表征  101-102
  3.5 本章小结  102-103
  参考文献  103-107
第四章磁性复合微球在蛋白分离纯化中的应用研究  107-134
  4.1 引言  107-109
  4.2 实验部分  109-110
    4.2.1 原料  109
    4.2.2 相关试剂的配制  109-110
    4.2.3 分析方法  110
    4.2.4 样品表征与测试  110
  4.3 结果及讨论  110-128
    4.3.1 S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)蛋白浓度的确定  110-112
      4.3.1.1 蛋白质的诱导表达  111
      4.3.1.2 蛋白质浓度的确定  111-112
    4.3.2 SAMS蛋白初始浓度对蛋白纯化的影响  112-114
    4.3.3 咪唑洗脱液浓度对SAMS蛋白纯化的影响  114-117
    4.3.4 盐浓度(离子强度)对SAMS蛋白纯化的影响  117-119
    4.3.5 介质pH值对SAMS蛋白纯化的影响  119-122
    4.3.6 不同金属离子对SAMS蛋白纯化的影响  122-125
    4.3.7 磁性载体纯化SAMS蛋白的最佳条件  125-128
  4.4 本章小结  128-129
  参考文献  129-134
第五章全文总结  134-136
附录:高度交联单分散聚苯乙烯微球的制备研究  136-148
  A.1 本部分的研究说明  136-137
  A.2 引言  137
  A.3 实验部分  137-139
    A.3.1 原料  137-138
    A.3.2 一次加料法制备交联的PS微球  138
    A.3.3 延迟加入DVB法制备交联的PS微球  138
    A.3.4 一次加料法制备交联的Poly(St/HEMA)微球  138
    A.3.5 延迟加入DVB法制备交联的Poly(St/HEMA)微球  138
    A.3.6 表征与测试  138-139
  A.4 结果与讨论  139-146
    A.4.1 一次加料法制备交联的PS微球  139-140
    A.4.2 延迟加入DVB法制备交联的PS微球  140-144
    A.4.3 一次加料法制备交联的Poly(St/HEMA)微球  144-145
    A.4.4 延迟加入DVB法制备交联的Poly(St/HEMA)微球  145-146
  A.5 本章小结  146-148
参考文献  148-151
文章及专利  151-152
致谢  152-153

模板细乳液聚合法制备磁性复合微球及其在蛋白分离纯化中的应用

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