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小分子化合物ADS-J1抑制HIV-1进入靶细胞的作用机理研究

作　者: 王洪涛
导　师: 吴曙光；姜世勃；刘叔文
学　校: 南方医科大学
专　业: 药理学
关键词: 人类免疫缺陷病毒Ⅰ型包膜糖蛋白跨膜糖蛋白亚基小分子进入抑制剂六螺旋束结构
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)通过它的包膜糖蛋白表面gp120亚基与靶细胞上CD4和辅助受体分子／黏附分子受体(趋化因子受体CXCR4和CCR5等)先后发生结合而进入靶细胞。随后包膜糖蛋白跨膜亚基gp41构象发生改变,其N-末端的融合肽插入到宿主细胞膜内,启动病毒包膜和靶细胞膜融合,完成病毒进入宿主细胞的感染过程。因此,HIV-1 gp41在病毒进入靶细胞的早期环节起关键作用,另外,gp41也可以作为开发HIV-1进入抑制剂的一个重要靶点。HIV gp41由345个氨基酸组成,位于512～856残基区段(按HIV-1HXB2毒株包被蛋白编码)。gp41是病毒包膜上介导HIV与靶细胞膜融合的跨膜糖蛋白亚基,其包膜外区(aa 512-683)包括三个重要的功能区：位于gp41 N-末端的融合肽(FP),N-末端重复序列(NHR)和C-末端重复序列(CHR)。衍生于gp41 N-末端重复序列和C-末端重复序列的肽,分别称为N-多肽和C-多肽,它们具有强效的抗HIV-1感染的抗病毒活性。C-多肽T-20(商品名Fuzeon) 2003年3月获得美国FDA批准用于治疗HIV-1感染者和AIDS病人,尤其用于那些对现有抗HIV药物出现耐药反应的患者的治疗,成为继逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂后的第三类抗艾滋病药物,即HIV融合抑制剂。然而,T-20作为肽类药物,分子量大(超过4000 Da),容易被内源性蛋白酶降解,不能口服,只能注射,而且用量大(每次100 mg,2次／天),合成步骤多,成本高,药品费用太昂贵(约2万美元／人／年)。另外,大分子量的肽类药物还可能导致机体产生抗体,降低疗效,诱发免疫复合物反应。因此,寻找低成本、可口服用药能代替T-20的小分子化合物是当前HIV进入抑制剂研究的方向。在研究C-多肽抑制HIV-1融合作用机理的过程中发现,gp41的C-多肽和N-多肽以相同的摩尔浓度混合,能形成一个由反向平行异源二聚物组成、稳定的α-螺旋三聚体,代表融合活性gp41核心结构。X-光晶体衍射分析揭示,这是一个六股α-螺旋束结构,其中三个NHR组成的N-螺旋相互作用形成位于中心的三聚体复合螺旋核(coiled-coil),而三个CHR组成的C-螺旋以反向平行的方式分别结合在复合螺旋核心的三个沟槽中。C-螺旋主要通过和中心复合螺旋三聚体表面沟槽中的疏水氨基酸结合来与N-螺旋相互作用。N-螺旋三聚体表面的每一个沟槽都包含一个容纳gp41 C-末段重复三个保守的疏水氨基酸的疏水深口袋区,这个区域成为HIV-1融合抑制剂开发的焦点。然而,六股α-螺旋束结构中的这个疏水口袋区被C-多肽覆盖,不能用来检测化合物的亲合力。N-多肽在水溶液容易聚集,不能形成可溶性的N-螺旋三聚体,为了解决这一问题,Eckert等人将GCN4序列与形成疏水口袋区的N-多肽N17联接起来,构建了一个可溶性的杂交分子IQN17,IQN17在体外能模拟形成gp41三聚体上的口袋区结构。利用IQN17, Welth等人找到一个环状的由D型氨基酸组成的抗HIV-1短多肽,命名为PIE7。PIE7能特异性地同IQN17的口袋区相结合。以gp41作为靶标,我们以前借助计算机辅助分子对接技术对一个包含2万种化合物的化合物库进行初级筛选；随后,利用能特异性识别六螺旋束结构单克隆抗体(mAb)NC-1的酶联免疫吸附分析(ELISA)对200种在对接分析中得到最高得分的小分子化合物进行次级筛选,在国际上首次获得的一个可能通过同gp41的口袋区相结合来干扰gp41复合螺旋核心结构形成的抗HIV-1的小分子化合物,命名为ADS-J1。然而,一直没有直接的证据来证明ADS-J1的作用机理,最近还有研究表明,ADS-J1还可能与HIV包膜蛋白gp120结合。本文的研究目的在于弄清ADS-J1抑制HIV-1感染靶细胞的作用机理,为开发设计更多和更有效的小分子HIV进入抑制剂奠定基础。本研究我们通过time-of-addition实验和HIV-1病毒介导的细胞融合实验显示,ADS-J1是一种HIV进入抑制剂。进一步的作用机制研究确定ADS-J1既不能阻止gp41-CD4之间的结合,又不能与HIV-1的辅助受体CXCR4相互作用。然而,通过酶联免疫吸附分析(ELISA)、天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(N-PAGE)和圆二色谱(CD)分析确定,ADS-J1抑制了衍生于病毒gp41 N-末端重复序列(NHR)和C-末端的重复序列(CHR)多肽所模拟的融合活性核心结构的形成。此外,运用等离子表面共振(SPR)实验,我们发现ADS-J1能直接与一个包含gp41口袋区的三聚体多肽IQN17结合,导致后者的构象发生变化而不能结合另外一个小的D-肽PIE7。我们采用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳第一次用直观的证据发现,ADS-J1能直接同N-多肽结合且结合靶点位于复合螺旋核中的口袋区(氨基酸565-581)。位于gp41口袋区第574位带正电荷的赖氨酸(K574)在ADS-J1与N-多肽的结合中起关键作用,用带负电荷的氨基酸替换K574则完全消除了ADS-J1同N-多肽相互作用。上述所有结果表明,ADS-J1通过疏水和离子作用与位于口袋区的带正电荷的疏水氨基酸相互作用结合到HIV-1病毒gp41N-末端重复序列,导致病毒的N-末端重复序列和C-末端的重复序列不能连接形成融合活性gp41核心结构,最终抑制了HIV-1介导的细胞膜融合和病毒进入。此外,可以利用ADS-J1作为先导物,来设计开发新型高效和低毒的HIV进入抑制剂。研究方法：一、ADS-J1抗HIV-1感染的活性检测方法：MT-2细胞与HIV-1ⅢB病毒混合,分别共同孵育0、1、2、3、4、6和8小时。加入ADS-J1后继续孵育。对照组中每孔加入AZT。洗去游离的病毒和ADS-J1,换上新的培养液后再孵育。四天后,收集培养上清,用5%Triton X-100完全裂解病毒颗粒。稀释的HIVIG抗体4℃包被过夜。脱脂奶粉封闭,PBS-T充分洗板。加入病毒裂解液,再孵育和洗板。加入抗p24的单克隆抗体183-12H-5C,继续孵育和洗板。依次加入生物素标记的羊抗鼠IgG和链亲合素标记的辣根过氧化酶(SA-HRP),孵育和洗板。每孔加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)液显色。加入终止液终止反应。然后在酶标仪以450 nm测量波长(570 nm参考波长)读取各孔的光密度值。最后用CalcuSyn (Biosoft公司产品)软件来计算待测多肽抑制HIV-1复制的活性及IC50。二、HIV-1介导的细胞融合实验。按文献22,25和33所述的方法,通过一个染料转移的试验来确定HIV-1介导的细胞融合实验。荧光试剂Calcein-AM标记的H9/HIV-1ⅢB细胞分别不同浓度的ADS-J1混合,孵育后按1：5的细胞比例,加入MT-2细胞中,继续孵育2小时。荧光倒置显微镜,根据荧光弥散现象,记数融合及未融合的细胞。最后按文献22所述的方法计算抑制百分比和EC50值。三.ADS-J1抑制gp41同CD4相互作用的实验。按文献56所述的方法,来检测有或没有抑制剂ADS-J1存在的情况下gp41同CD4的相互作用。羊抗gp120单克隆抗体D7324稀释液4℃包被过夜。脱脂奶粉封闭和充分洗板。依次加入的重组gp120、sCD4、兔抗sCD4抗体后孵育和充分洗板。依次加入生物素标记的羊抗鼠IgG和链亲合素标记的辣根过氧化酶(SA-HRP),孵育和洗板。每孔加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)液显色。加入终止液终止反应。然后在酶标仪以450 nm测量波长(570 nm参考波长)读取各孔的光密度值。四.ADS-J1抑制CXCR抗体与CXCR表达细胞结合的细胞酶联免疫吸附试验。按文献55所述的方法,U373-MAGI-CXCR4CEM细胞过夜培养直至铺满底层。室温条件下,用5%的甲醛溶液固定细胞。用PBS-T溶液洗板和脱脂奶粉封闭。加入单克隆抗体12G5(对照组中加入IgG2a)后孵育充分洗板。依次加入生物素标记的羊抗鼠IgG和链亲合素标记的辣根过氧化酶(SA-HRP),孵育和洗板。每孔加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)液显色。加入终止液终止反应。然后在酶标仪以450 nm测量波长(570 nm参考波长)读取各孔的光密度值。五、检测六螺旋束形成的酶联免疫吸附试验的实验。兔抗gp41多抗4℃包被过夜。脱脂奶粉封闭后洗板。N36中加入不同浓度的ADS-J1,孵育后加入C34,继续孵育。将上一步孵育好的混合液移入已包被和封闭好的相应孔中,孵育和洗板。加入单克隆抗体NC-1,孵育后洗板。依次加入生物素标记的羊抗鼠IgG和链亲合素标记的辣根过氧化酶(SA-HRP),孵育和洗板。每孔加入3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)液显色。加入终止液终止反应。然后在酶标仪以450 nm测量波长(570 nm参考波长)读取各孔的光密度值。对照组将N36与C34孵育后,再加入ADS-J1,按上述方法检测A450光密度值。六、天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(N-PAGE)实验。N36加入PBS或不同浓度的ADS-J1,孵育后加入C34(使N36和C34的终浓度达到40μM),混合物继续孵育。孵育好的混合液与2×Tris-甘氨酸天然凝胶上样缓冲液混匀,加样到10×0.1cm的天然聚丙烯酰胺凝胶孔中(每孔25μl),室温下静置5分钟。室温125V电压电泳2小时,考马斯亮蓝R250染色2小时,脱色后用FluorChem 8800凝胶成像仪拍照记录。七、免疫印迹检测六螺旋束。N36/C34经过N-PAGE电泳之后转到硝酸纤维膜上。膜切成带状,用封闭溶液(含有5%脱脂奶粉的TBS)4℃条件下封闭过夜。用PBS稀释的单克隆抗体NC-1(10μg/ml)与膜孵育2小时。依次加入生物素标记的羊抗鼠IgG链霉亲合素标记的辣根过氧化酶(SA-HRP),37℃条件下各孵育1小时。加入化学发光试剂。压片并记录图像。八、圆二色谱分析。N36、C34和ADS-J1溶解于PBS (pH7.2)中。N36分别与ADS-J1和PBS孵育后加入C34。多肽(N36、C34)和ADS-J1的终浓度分别为10μM和40μM。继续孵育后冷却到室温。N36、C34、N36与C34的复合物和ADS-J1的反应物用Jasco分光偏振仪测定圆二色谱。参数设置：检测温度：4℃,样品池：0.1cm,波长扫描范围：180～300nm,波宽：5.0 nm,狭缝0.1 nm,时间常数4.0 s,扫描速度：50 nm／min。以N36和C34在37℃孵育后的复合物作为阳性对照,空白溶液做为阴性对照。在222 nm以5℃／min的温度剃度变化监测多肽的热变性。减去缓冲液的空白对照来校正谱值。对溶解曲线进行平滑化处理,并用Jasco应用软件计算热解离转变的中点温度,即Tm值。九、表面等离子共振测定。通过氨基共价偶联将生物素标记的IQN-17(2μg／ml)固定到链霉亲和素传感器(CM5)的表面,用1M浓度的Tris-HCl (pH8.5)来封闭未发生反应的传感器的表面。芯片用磷酸缓冲液(pH7.4,20μg/ml)进行洗涤和平衡。加入用流动相(PBS)稀释的不同浓度的ADS-J1,注射体积为200μl,流速为5μl／min,25℃条件下测量,结合时间为10min,接着进行15min的解离。每个循环结束后,用0.1 M盐酸甘氨酸(pH 2.5)作用30秒来复性传感器芯片。用商业化的BIAeval Version3.0软件对共振数据进行分析,计算动力学解离常数。ADS-J1与生物素标记IQN-17的亲和力通过他们之间剂量依赖的结合来确定。每个实验重复三次。AMD-3100、生物素标记的PIE7和乱序的生物素标记的PIE7用作ADS-J1的空白对照,多肽IQ用作IQN-17的空白对照。十、酸性天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(AN-PAGE)。多肽N36、N36-F17、N36-F10、和N36K574D(终浓度为80μM)分别加入或不加ADS-J1(终浓度为50μM),37℃条件下孵育30分钟。孵育好的混合液与等量的2×酸性胶上样缓冲液混匀,加样到10%的酸性聚丙烯酰胺凝胶孔中(每孔25-30μl),室温条下静置5分钟。室温下120V电压电泳100至120分钟(反接电极),凝胶在固定液(0.5%戊二醛,30%乙醇)中固定20分钟。考马斯亮蓝R250染色、脱色及拍照记录。实验结果：一、Time-of-addition实验显示,ADS-J1通过阻止HTV-1进入靶细胞来抑制病毒复制。ADS-J1在HIV-1病毒与MT-2混合一小时后加入,则其对p24产量的抑制作用明显下降,而对照的AZT即使是在病毒感染细胞八小时后加入,它对p24产量的抑制作用没有明显下降,这表明ADS-J1通过作用于HIV-1早期的进入阶段,来抑制HIV-1病毒的复制。二Time-of-removal实验显示,10μM浓度的ADS-J1完全抑制了H9/HIV-1ⅢB和MT-2细胞的融合。若ADS-J1和MT-2细胞在37℃下孵育30分钟,洗去未结合的ADS-J1后,再加入H9/HIV-1ⅢB细胞,ADS-J1就没有了抑制细胞融合的活性。这表明,ADS-J1不是与HIV-1未感染的靶细胞结合,而是作用于HIV-1感染细胞。然而,如果ADS-J1和H9/HIV-1ⅢB细胞在37℃下孵育30分钟,洗去未结合的ADS-J1后,再加入MT-2细胞,ADS-J1就只有部分(约50%)抑制活性。若ADS-J1加上HIV的可溶性受体分子sCD4后与H9/HIV-1ⅢB共孵育,洗涤后加入MT-2细胞,ADS-J1就有80%的抑制活性。这些结果表明ADS-J1的抑制活性与靶细胞有关,可能是作用于介导病毒与靶细胞融合的跨膜亚基gp41。其原因可能是sCD4通过与HIV包膜蛋白gp120结合,促进gp41的暴露,导致ADS-J1有机会与gp41结合,抑制病毒诱导的融合作用。Time-of-removal实验显示,ADS-J1通过与HIV-1感染细胞的作用,抑制HIV-1诱导的细胞融合。三、Chloropetin在10μg／ml的浓度下明显地抑制gp120与CD4分子的结合；而相同浓度的ADS-J1和C34对gp120与CD4分子的结合没有显著的抑制作用。表明ADS-J1并不能作用于gp120与CD4分子的结合这一环节。T-22在25μM的浓度下明显地抑制12G5与U373-MAGI-CXCR4CEM细胞结合,然而,相同浓度的ADS-J1和C34对二者的结合没有显著的抑制作用。表明ADS-J1不能与ADS-J1的辅助受体相互作用。四、ADS-J1能抑制gp41形成六螺旋束,且半数抑制浓度(IC50)为3.2±0.3μM。然而,一旦N36和C34预先形成六螺旋束后,ADS-J1就没有了抑制活性。上述结果表明ADS-J1的作用只是破坏gp41的六螺旋束核心结构,而对已形成的gp41核心结构没有抑制作用。当浓度为40μM的ADS-J1和N36孵育后再加入C34时,六螺旋束的条带消失；N36和C34反应后加入ADS-J1该条带则显现出来。对于逆转录酶抑制剂AZT,则无论在N36和C34混合前后加入,均不能抑制六螺旋束的形成。ADS-J1的抑制作用具有剂量的依赖性。这些结果进一步表明,ADS-J1可干扰gp41六螺旋束的形成,而不是破坏已经形成的六螺旋束。五、圆二色谱实验显示,ADS-J1能显著干扰N36和C34二者之间的相互作用,因为,ADS-J1和N36混合之后再加入C34,六螺旋束的α-螺旋度显著减少。然而,N36和C34一旦形成复合物之后,ADS-J1就不能改变已经形成的α-螺旋结构了。这些结果确定,ADS-J1干扰N-多肽和C-多肽相结合形成α-螺旋复合物。六、表面等离子共振实验显示ADS-J1的确能IQN17结合；不能同IQ结合。另外,IQN17显然能同固定在传感芯片上的生物素标记的PIE7相结合(上面的曲线),但是不能同生物素标记的乱序的PIE7相结合。当ADS-J1和IQN17孵育之后再PIE7混合,ADS-J1也失去同PIE7结合的能力。ELISA实验显示,ADS-J1显著抑制PIE7与IQN17的结合,IC50达到0.68μM,对照组的化合物AMD-3100(一种CXCR4拮抗剂)对IQN17同PIE7的结合没有任何作用。这些结果进一步表明,ADS-J1同gp41中心N-螺旋三聚体上的口袋区相互作用,抑制了HIV-1病毒N-末端重复序列和-末端重复序列间的相互作用,使其不能形成六螺旋束核心结构,最终抑制了病毒的进入及其复制。七、ADS-J1同IQN17结合引起IQN17的构象发生改变。生物素标记的IQN17被固定在链亲合素标记的传感芯片上,按剃度浓度(0.02-2.50μM)注入ADS-J1,实验结果用BIAeval Version3.0软件进行分析。数据按1：1的匹配模式时,ADS-J1同IQN17结合亲和力为～4.3x10-7M,这个数值同用ELISA测得的抑制IQN17和生物素标记的PIE7结合所需的ADS-J1的水平相近；亲和常数和解离常数分别为3.3x103ms-1和1.4x103 ms-1。ADS-J1结合曲线完全符合构象改变的模式,这表明ADS-J1与IQN17结合引起IQN17的构象发生改变。单独的IQN17是一个在208 nm和222 nm处有明显负蜂的典型α-螺旋的结构。IQN17同ADS-J1混合孵育后,222 nm处的负蜂显著减少,反映出同ADS-J1结合导致IQN17的螺旋性的减少。所有这些结果表明,ADS-J1同IQN17的结合引起了IQN17的构象发生改变。八、ADS-J1不是通过与gp41 CHR结合而是与gp41 NHR结合来抑制六螺旋束核心结构形成的。ADS-J1能与N36结合,导致N36的条带在凝胶上消失,但不能影响N36-F10和N36-F17条带位置的改变,表明ADS-J1能与NHR结合,且作用位点在序列572-581之间,该区域正是NHR的口袋区。因此ADS-J1可能与口袋区中的氨基酸残基相互作用。ADS-J1不影响N36K575D条带位置的改变,表明ADS-J1不与N36K574D结合。另外,我们的研究发现,虽然C34突变体C34D632K能同N36作用形成六螺旋束结构,但其螺旋度和稳定性远远底于C34同N36作用形成六螺旋束结构。ADS-J1能抑制N36和C34D632K作用形成六螺旋束结构,但不能抑制N36K574D和C34D632K作用形成六螺旋束结构。所有这些结果表明,ADS-J1抑制gp41六螺旋束结构的形成是通过与NHR的口袋区域结合而导致的,其中K574对gp41六螺旋束结构的抑制活性起着关键的作用。根据上述的实验结果,本文得出以下结论：一、Time-of-addition实验和HIV-1病毒介导的细胞融合实验显示,ADS-J1是一种HIV进入抑制剂。二、ADS-J1既不能阻止gp120-CD4之间的结合,又不能与HIV-1的辅助受体CXCR4相互作用。三、通过酶联免疫吸附分析(ELISA)、天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(N-PAGE)和圆二色谱(CD)分析确定,ADS-J1抑制了衍生于病毒gp41 N-末端重复序列(NHR)和C-末端的重复序列(CHR)多肽所模拟的融合活性核心结构的形成。四、等离子表面共振(SPR)实验,我们发现ADS-J1能直接与一个包含gp41口袋区的三聚体多肽IQN17结合,导致后者的构象发生变化而不能结合另外一个小的D-肽PIE7。五、采用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳第一次用直观的证据发现,ADS-J1能直接同N-多肽结合且结合靶点位于复合螺旋核中的口袋区(氨基酸565-581)。位于gp41口袋区第574位带正电荷的赖氨酸(K574)在ADS-J1与N-多肽的结合中起关键作用,用带负电荷的氨基酸替换K574则完全消除了ADS-J1同N-多肽相互作用。综上所述,ADS-J1通过疏水和离子作用与位于口袋区的带正电荷的疏水氨基酸相互作用结合到HIV-1病毒gp41 N-末端重复序列,导致病毒的N-末端重复序列和C-末端的重复序列不能连接形成融合活性gp41核心结构,最终抑制了HIV-1介导的细胞膜融合和病毒进入。因此,利用ADS-J1作为先导物,来设计开发新型高效和低毒的HIV进入抑制剂。另外,本研究确立的酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,也为研究靶向gp41的小分子HIV进入抑制剂的作用机制,提供了一个有效的研究工具和方法。

全文目录

摘要  3-13
ABSTRACT  13-31
前言  31-52
  一、AIDS的现状  31-32
  二、人免疫缺陷病毒(HIV)  32-34
  三、治疗艾滋病的药物  34-35
  四、HIV-1包膜糖蛋白的结构特征  35-37
  五、Gp41的结构特征和融合特性  37-41
  六、作用于Gp41的多肽抑制剂  41-46
  七、作用于Gp41的小分子化合物  46-49
  八、本文的研究目的与内容  49-52
第一章 ADS-J1通过阻止HIV-1进入靶细胞来抑制病毒复制  52-56
  第1节实验材料与仪器设备  52-53
  第2节实验方法与步骤  53-54
  第3节实验结果  54-56
第二章 ADS-J1通过与HIV-1感染细胞的作用来抑制HIV-1诱导的细胞融合  56-59
  第1节实验材料与仪器设备  56
  第2节实验方法与步骤  56-57
  第3节实验结果  57-59
第三章 ADS-J1既不能阻断gp120-CD4之间的结合,又不能与HIV-1的辅助受体CXCR4相互作用  59-64
  第1节实验材料与仪器设备  59-60
  第2节实验方法与步骤  60-61
  第3节实验结果  61-64
第四章 ADS-J1可阻止gp41六螺旋束核心结构的形成  64-70
  第1节实验材料与仪器设备  64-66
  第2节实验方法与步骤  66-68
  第3节实验结果  68-70
第五章 ADS-J1干扰N-多肽与C-多肽相互作用过程中构象发生改变  70-73
  第1节实验材料与仪器设备  71
  第2节实验方法与步骤  71
  第3节实验结果  71-73
第六章 ADS-J1能够抑制PIE7与gp41三聚体口袋区的结合  73-79
  第1节实验材料与仪器设备  74
  第2节实验方法与步骤  74-76
  第3节实验结果  76-79
第七章 ADS-J1同IQN17结合引起IQN17的构象发生改变  79-82
  第1节实验材料与仪器设备  79
  第2节实验方法与步骤  79-80
  第3节实验结果  80-82
第八章带正电的K574在ADS-J1同NHR的口袋区结合中起关键作用  82-88
  第1节实验材料与仪器设备  82-83
  第2节实验方法与步骤  83-84
  第3节实验结果  84-88
讨论  88-93
结论  93-94
参考文献  94-106
中英文缩略词  106-109
攻读学位期间论文发表情况  109-110
致谢  110-112
统计学合格证明  112-113
发表文章  113-124

小分子化合物ADS-J1抑制HIV-1进入靶细胞的作用机理研究

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