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新型Src激酶抑制剂BRP800对人肺腺癌细胞株H1299生长抑制作用及其机制研究

作　者: 陈刚
导　师: 凌春华
学　校: 苏州大学
专　业: 内科学
关键词: Src激酶抑制剂 BRP800 人肺腺癌 生长抑制 分子机制
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的:研究新型Src激酶抑制剂BRP800对人肺腺癌细胞株H1299细胞增殖和凋亡影响,并初步探讨其可能的分子机制。方法:(1)将BRP800作用于人肺腺癌细胞细胞H1299,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测吸光度值,计算对照组和各实验组细胞的生长抑制率。(2)倒置显微镜观察BRP800作用后的H1299细胞形态学变化。(3)流式细胞仪(FCM)检测BRP800作用于人肺腺癌H1299 24h后细胞周期的变化,以及凋亡作用,计算细胞凋亡率;(4)Western Blot法检测Src激酶及其信号通路上蛋白以及与细胞周期、凋亡相关的蛋白因子的表达。(5)RT-PCR法检测BRP800作用于H1299细胞24h后CyclinD3、CDK4表达水平的变化。结果:(1)MTT法显示BRP800能有效抑制H1299细胞的生长,呈时间和剂量依赖性,BRP800和Dasatinib各浓度组与10nM组之间差异均有统计学意义(P<0.05)。同一实验组在不同时间点之间差异有统计学意义(P<0.05)。(2)BRP800作用于H1299 24h后可见细胞固缩,视野内细胞密度稀疏,细胞与细胞间粘附下降,细胞活性降低,生长缓慢。比较BRP800组与Dasatinib组,发现前者在浓度30nM时的抑制作用同后者300nM相似。(3)流式细胞术检测显示H1299细胞经BRP800作用24小时后可见细胞周期G0/G1期明显阻滞,且随着浓度的增加H1299细胞周期G0/G1期比例增加,S期、G2/M期细胞比例下降。同时,不同浓度BRP800作用于H1299 72小时后,未能诱导细胞凋亡,对照组及各实验组之间差别均无统计学意义(p>0.05)。(4)Western Blot分析:①细胞周期蛋白(Cyclins):CyclinA、B1、D1、D3、E;②周期蛋白依赖激酶(CDKs):CDK4、6、9;③CDKs抑制剂(CKIs)P21、27;④磷酸化的视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)和p53。结果显示不同浓度的BRP800组作用24h后,参与调控细胞周期G1至S期过程的周期蛋白CyclinD1、D3、E及周期蛋白依赖激酶CDK4、CDK6呈剂量依赖性下降,其中CyclinD3、CDK4同时出现时间依赖性下降; BRP800亦诱导了CDKs抑制剂P21、P27蛋白表达水平,呈显著的剂量依赖性上调;P53是G1期DNA损伤检测点,如有损伤,P53蛋白阻断细胞周期(即阻止DNA复制),以提供足够的时间使损伤DNA修复。P53蛋白经BRP800作用后蛋白表达水平上调,在浓度3nM时其蛋白表达即被诱导显著上调。pRb是G1期的Cyclin-CDK复合物介导的磷酸化作用的共同的限速底物,因此是G1期至S期调控点的中心成分,经BRP800作用后pRb蛋白表达呈剂量依赖性下降,在BRP800浓度100nM时被完全抑制。而参与调控细胞周期S、G2、M期过程的周期蛋白CyclinA、B1、周期蛋白依赖激酶CDK9均未见明显变化。(5)Western Blot分析参与凋亡的Casepase家族蛋白Casepase3、8、9,凋亡标志物PARP(poly ADP-ribose polymerase),以及抗凋亡Bcl-2家族蛋白Mcl-1、Bcl-2,均未见明显变化。(6)Western Blot检测Src激酶及其信号通路上蛋白Src、pSrc(Tyr416)、Akt、pAkt(Ser473)蛋白表达情况,发现BRP800对Src激酶有轻度的抑制,pSrc(Tyr416)蛋白几乎完全被抑制;Akt未见明显变化,pAkt(Ser473)蛋白表达在BRP800浓度10nM时即出现抑制,但在300nM下仍有表达;(7)RT-PCR结果显示CyclinD3、CDK4的mRNA表达明显下降,与蛋白水平表达一致。结论:(1)通过MTT法发现BRP800对人肺腺癌H1299细胞具有生长抑制作用,并呈时间、剂量依赖性;(2)倒置显微镜下观察显示BRP800可使人肺腺癌H1299细胞固缩,视野内细胞密度稀疏,细胞与细胞间粘附下降,细胞活性降低,生长缓慢。(3)细胞流式检测显示BRP800使人肺腺癌细胞株H1299细胞阻滞于细胞周期G0/G1期,但BRP800未能诱导人腺肺癌细胞株H1299凋亡。(4)Western Blot检测细胞周期相关蛋白表达进一步证实了BRP800作用于细胞周期G0/G1期。(5)BRP800具有抑制Src激酶活性,其对人肺腺癌H1299的生长抑制的分子机制可能通过阻断Src/PI3K /AKT激酶级联信号转导通路发挥作用。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-10
引言  10-16
第一部分 BRP800 对人肺腺癌细胞株H1299 的生长抑制作用  16-26
  一 材料和方法  16-19
  二 结果  19-21
  三 讨论  21-24
  参考文献  24-26
第二部分 BRP800 对人肺腺癌细胞株H1299 生长抑制的分子机制研究  26-52
  一 材料与方法  26-34
  二 结果  34-43
  三 讨论  43-50
  参考文献  50-52
结论  52-53
综述  53-65
  参考文献  60-65
中文对照缩略词表  65-67
攻读学位期间发表的论文  67-68
致谢  68-69

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 呼吸系肿瘤 > 肺肿瘤
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