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NaCl胁迫下小黑杨差异表达基因及其功能分析

作　者: 王雷
导　师: 姜廷波
学　校: 东北林业大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: 小黑杨 cDNA-AFLP 环锌指蛋白转基因
分类号: S792.11
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
下　载: 217次
引　用: 2次
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内容摘要

为研究小黑杨在不同盐浓度和不同胁迫时间的生理响应,本实验测定0、75、150、250 mM NaCl胁迫下,小黑杨第6小时和第1、2、4、6、8天的SOD活性、POD活性、MDA含量及叶绿素相对含量,结果表明：随着胁迫时间的延长和盐浓度的增加,小黑杨叶绿素相对含量逐渐降低,MDA含量升高。POD和SOD的活性则呈现逐渐增强后减弱的趋势。通过对小黑杨叶部形态观察发现,250 mM NaCl胁迫第二天,叶片失水,叶柄变软；随着胁迫的持续进行,叶片萎蔫变黄直至最后变成褐色,卷曲变脆。以上结果表明小黑杨并非强耐盐植物,对低浓度盐有一定耐受性,但高浓度盐则会对其造成伤害。为进一步研究盐胁迫下小黑杨基因应答机理,以正常生长和盐胁迫下的小黑杨叶片为试材,进行cDNA-AFLP分析。64对引物组合共获得4407条转录基因片段,其中差异片段2027条(其中上调表达996条,下调表达1031条)。回收161条差异条带,成功再扩增与克隆121条差异片段,测序得到107条原始序列,经聚类分析后得到86条唯一序列,Genbank登录号为GW672587-GW672672,其功能涉及转录调控、应激反应、光合作用、信号转导、代谢等10个功能类别。其中功能未知的基因占最高比例,约为18.6%；其次为参与代谢的基因,约占17.44%；参与转录调控的基因约为12.79%,信号转导的基因占11.63%；,与细胞合成相关的基因占10.47%,转运占4.65%,细胞降解占4.65%,参与应激反应的基因占5.81%、发育相关基因占6.98%、光合作用与氧化还原的基因均占6.98%。环锌指蛋白基因是小黑杨盐胁迫后诱导表达的基因,应用RACE技术克隆出具有完整开放读码框的小黑杨环锌指蛋白(PsnRZF)基因,该基因全长1061 bp,其中5’非翻译区为184 bp,3’非翻译区为82 bp,开放读码框为795 bp,编码264个氨基酸,预测蛋白的分子量为30.25 kDa,理论等电点为8.04。实时定量PCR检测的结果显示：小黑杨PsnRZF基因在不同器官中表达量存在差异,该基因在叶中的表达量最高,其次为茎,在根中的表达量最低。随着胁迫时间的延长,PsnRZF基因在叶和茎中的表达量变化均呈现逐渐升高后降低的趋势,在叶中该基因表达量峰值出现在胁迫后的第6天,在茎中该基因表达量峰值出现在胁迫后的第4天；而在根中,该基因表达量的变化不显著。为验证小黑杨环锌指蛋白(PsnRZF)基因的功能,构建植物表达载体,利用农杆菌介导法将小黑杨环锌指蛋白基因导入烟草中。通过对正常生长条件下和盐胁迫条件下,转基因烟草生理指标的检测发现,PsnRZF基因在不同的生长条件下,可能发挥不同的功能。在正常生长条件下,PsnRZF基因的过量表达对植物体来说是有害的；但在盐胁迫条件下,PsnRZF基因的过量表达可以缓解膜脂的过氧化作用。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-12
1 绪论  12-23
  1.1 引言  12
  1.2 植物的盐胁迫生理  12-15
    1.2.1 盐胁迫对植物的危害  12-13
    1.2.2 植物在分子细胞水平的盐应答机理  13-15
  1.3 cDNA-AFLP技术及其应用  15-19
    1.3.1 cDNA-AFLP基本原理  15-16
    1.3.2 cDNA-AFLP技术的应用  16-19
  1.4 关于小黑杨的研究  19-20
  1.5 环锌指蛋白研究进展  20-21
  1.6 本课题研究的目的和意义  21
  1.7 本研究的内容和技术路线  21-23
2 NaCl胁迫下小黑杨的生理响应  23-32
  2.1 材料  23-24
    2.1.1 植物材料  23
    2.1.2 主要仪器  23
    2.1.3 主要试剂  23-24
  2.2 方法  24-25
    2.2.1 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定  24
    2.2.2 过氧化物酶(POD)活性测定  24-25
    2.2.3 丙二醛(MDA)含量测定  25
    2.2.4 叶绿素相对含量的测定  25
    2.2.5 统计方法  25
  2.3 结果与分析  25-30
    2.3.1 NaCl胁迫下小黑杨叶部形态观察  25
    2.3.2 NaCl胁迫下小黑杨SOD活性测定  25-27
    2.3.3 NaCl胁迫下小黑杨POD活性测定  27-28
    2.3.4 NaCl胁迫下小黑杨MDA含量测定  28-29
    2.3.5 NaCl胁迫下小黑杨叶绿素相对含量测定  29-30
  2.4 讨论  30-31
  2.5 本章小结  31-32
3 NaCl胁迫下小黑杨cDNA-AFLP分析  32-53
  3.1 材料  32-33
    3.1.1 植物材料  32
    3.1.2 主要仪器  32
    3.1.3 菌种与载体  32
    3.1.4 主要试剂  32-33
  3.2 方法  33-40
    3.2.1 总RNA的提取与DNase Ⅰ处理  33-34
    3.2.2 双链cDNA的合成及纯化  34-35
    3.2.3 cDNA-AFLP  35-37
    3.2.4 差异片段的回收与再扩增  37
    3.2.5 再扩增产物琼脂糖凝胶回收  37-38
    3.2.6 差异片段的克隆与测序  38
    3.2.7 差异表达序列的生物信息学分析  38-39
    3.2.8 盐胁迫相关基因的表达分析  39-40
  3.3 结果与分析  40-49
    3.3.1 RNA的质量检测  40-41
    3.3.2 小黑杨cDNA-AFLP分析  41-42
    3.3.3 差异片段的回收、再扩增与克隆  42-43
    3.3.4 差异表达片段的生物信息学分析  43-46
    3.3.5 NaCl胁迫下小黑杨盐胁迫相关基因的表达分析  46-49
  3.4 讨论  49-52
  3.5 本章小结  52-53
4 小黑杨环锌指蛋白基因的克隆与表达分析  53-63
  4.1 材料与方法  53-56
    4.1.1 材料  53
    4.1.2 试剂  53
    4.1.3 方法  53-56
  4.2 结果与分析  56-61
    4.2.1 小黑杨环锌指蛋白基因全长cDNA的克隆  56
    4.2.2 小黑杨环锌指蛋白的基因及其推导编码蛋白的生物信息学分析  56-61
    4.2.3 NaCl胁迫下小黑杨环锌指蛋白基因的表达分析  61
  4.3 讨论  61-62
  4.4 本章小结  62-63
5 小黑杨环锌指蛋白基因功能验证  63-78
  5.1 材料  63-64
    5.1.1 菌种与载体  63
    5.1.2 植物材料  63
    5.1.3 试剂  63-64
  5.2 方法  64-69
    5.2.1 PsnRZF基因的植物表达载体构建  64-66
    5.2.2 植物表达载体对农杆菌EH105的转化  66
    5.2.3 转PsnRZF基因烟草的获得  66-67
    5.2.4 转PsnRZF基因烟草的分子检测  67-68
    5.2.5 NaCl胁迫下转PsnRZF基因烟草的生理变化  68-69
  5.3 结果与分析  69-76
    5.3.1 PsnRZF基因的植物表达载体构建  69-70
    5.3.2 转PsnRZF基因烟草的分子检测  70-71
    5.3.3 NaCl胁迫下转PsnRZF基因烟草的生理变化  71-76
  5.4 讨论  76
  5.5 本章小结  76-78
结论  78-79
参考文献  79-87
附录  87-96
攻读学位期间发表的学术论文  96-97
致谢  97-98

NaCl胁迫下小黑杨差异表达基因及其功能分析

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