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胰高血糖素样肽-2与断奶仔猪肠道发育、适应的关系及作用机理研究

作　者: 贾刚
导　师: 王康宁
学　校: 四川农业大学
专　业: 动物营养与饲料科学
关键词: 胰高血糖素样肽-2 断奶仔猪肠绒毛高度肠上皮细胞增殖代谢凋亡 DPP-Ⅳ抑制剂 β-伴球蛋白
分类号: S828.8
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

胰高血糖素样肽-2（Glucagon-like Peptide-2,GLP-2）通过促进小鼠、大鼠、胎猪、新生仔猪等动物的肠上皮细胞增殖、抑制细胞凋亡而影响肠黏膜发育、调节肠道营养、免疫功能已得到众多营养学家的认同,但能否影响断奶仔猪的肠道适应,对具有快速更新特点的断奶仔猪肠上皮细胞的作用效果尚不得而知。为回答这个问题,本研究采用以下几个实验来探讨GLP-2与断奶仔猪肠道发育的关系及对肠上皮细胞增殖、代谢、凋亡的作用特点,为进一步直接采用动物试验研究GLP-2对仔猪断奶应激综合征的调节及作用机理提供理论和试验依据。试验1不同基因型仔猪断奶前后GLP-2的分泌规律及与肠道发育的关系本试验通过考察太湖猪、大×太二杂猪和长白仔猪断奶前后GLP-2的分泌规律、肠道发育状况的差异,初步探讨具有不同生长速度仔猪的GLP-2分泌水平的高低及与肠道发育的关系。试验选择1日龄健康正常的太湖猪、大×太二杂猪和长白猪各20头,将每个不同基因型猪作为一个处理,每个处理5个重复,每个重复4头猪,仔猪饲养于环控实验室,25日龄断奶,分别于仔猪24、26和30日龄时每个重复选取一头接近平均体重的仔猪前腔静脉采血测定GLP-2浓度,并于30日龄时屠宰仔猪测定肠道发育参数,并分析30日龄小肠绒毛高度与24日龄、26日龄、30日龄血清GLP-2浓度的关系。试验结果如下:仔猪30日龄时,大×太猪小肠长、小肠相对长、小肠相对重都显著高于长白猪（P＜0.05）,太湖猪小肠相对重显著高于长白猪（P＜0.05）,而小肠相对长极显著高于长白猪（P＜0.01）;30同龄时,大×太猪小肠绒毛高度高于长白猪和太湖猪（P＞0.05）,且血清GLP-2含量极显著高于长白猪和太湖猪（P＜0.01）;24日龄和26日龄时,大×太猪血清GLP-2含量极显著高于太湖猪（P＜0.01）;26日龄时,大×太猪血清GLP-2含量显著高于长白猪（P＜0.05）;30日龄小肠绒毛高度与各猪种血清GLP-2含量达极显著相关水平（P＜0.01）。研究结果表明,不同基因型仔猪断奶后GLP-2的活性逐渐升高,大×太猪GLP-2变化幅度最大,30日龄时其活性最高,肠道发育状况优于太湖猪和长白猪;三种猪30日龄血清GLP-2含量与30日龄小肠绒毛高度极显著相关。研究结果提示我们,选择大×太猪或其肠上皮细胞作为研究GLP-2调节仔猪断奶前后的肠道适应及可能的作用机理是可行的。在证实不同基因型仔猪断奶前后GLP-2的分泌水平及活性逐渐升高,而仔猪肠绒毛高度与循环中GLP-2浓度高度相关的基础上,课题组进一步研究了GLP-2对大×太断奶仔猪肠黏膜上皮细胞的营养效应（试验2）,研究发现GLP-2可以剂量依赖性地促进体外培养的28d断奶仔猪小肠黏膜上皮细胞增殖,抑制细胞凋亡,维持细胞形态和功能的完整性,课题组随即进行了下列研究。试验3 GLP-2和DPP-Ⅳ抑制剂联合使用对对断奶仔猪肠上皮细胞的影响本试验旨在研究不同浓度的胰高血糖素样肽-2（GLP-2）和二肽基肽酶Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制剂（KR62436）联合使用对体外原代培养的28日龄断奶仔猪肠上皮细胞增殖、代谢及相关酶活力的影响。试验以体外培养的28日龄断奶仔猪回肠上皮细胞作为模型,首先采用单因子试验设计探讨不同浓度的KR62436对细胞增殖及代谢的影响;然后采用2×3因子设计,考察添加不同浓度hGLP-2(1×10^-10、1×10^-9、1×10^-8 mol/L)和KR62436(0和1×10^-11mol/L)对细胞增殖、代谢及凋亡的影响,细胞培养时间共计144h。结果如下:单独添加KR62436,在倒置显微镜下观察发现细胞无明显变化,细胞数量虽有上升的趋势,但细胞MTT OD值、细胞沉积蛋白量、细胞总蛋白量呈现先增加后下降趋势（P＞0.05）,胞外LDH、CK活力在KR62436低剂量时呈降低趋势（P＞0.05）,但当其浓度较高时,细胞MTT OD值显著低于对照组（P＜0.05）,其胞外LDH、CK活力显著高于对照组（P＜0.05）,Na⁺,K⁺-ATP酶活力变化不明显;在培养液中同时添加KR62436和hGLP-2,随着hGLP-2浓度的增加,细胞数量极显著上升（P＜0.01）,MTT OD值极显著增加（P＜0.01）,细胞蛋白沉积量极显著增加（P＜0.01）,细胞总蛋白含量极显著增加（P＜0.01）,胞外LDH、CK活力显著降低（P＜0.05）,Na⁺,K⁺-ATP酶活力极显著增加（P＜0.01）。试验结果提示我们:低浓度DPP-Ⅳ抑制剂对细胞生长的影响不显著,高浓度抑制剂虽能促进仔猪肠上皮细胞的增殖,但对细胞的代谢和完整性有负面效应;在培养液中添加DPP-Ⅳ抑制剂能够增强外源GLP-2对细胞增殖、代谢和细胞完整性的影响,两者具有明显的协同效应。试验结果提示我们应用KR62436来提高GLP-2的作用效果要慎重。试验4 GLP-2对β-伴球蛋白损伤的28日龄断奶仔猪肠上皮细胞的保护、修复作用本试验主要考察GLP-2对28日龄断奶的大×太仔猪的肠上皮细胞被β-伴球蛋白损伤后存活、增殖、代谢、凋（死）亡的影响及可能的作用机理。试验首先采用单因子设计,分别用1.2mg/ml和2.4mg/ml的β-伴球蛋白对原代培养的断奶仔猪肠上皮细胞进行攻毒,通过考察对细胞存活、增殖、代谢及凋亡的影响而建立细胞损伤模型;然后再采用2×3因子设计,考察添加不同浓度的hGLP-2(1×10^-9、1×10^-8、1×10^-7mol/l)对致敏的培养细胞的影响。试验结果如下:使用β-伴球蛋白提取物攻毒,细胞MTTOD值显著降低（P＜0.05）,细胞蛋白质沉积量和细胞消耗蛋白量极显著降低（P＜0.01）,胞外LDH活力极显著增加（P＜0.01）,Na⁺,K⁺-ATP酶活力显著（P＜0.05）或者极显著（P＜0.01）降低,Caspase-3酶活力极显著（P＜0.01）升高;使用β-伴球蛋白攻毒的同时添加不同浓度的hGLP-2,细胞MTT OD值、细胞蛋白质沉积量、细胞消耗蛋白量和Na⁺,K⁺-ATP酶活力均显著或极显著（P＜0.05或0.01）升高,且随着hGLP-2浓度的增加而升高,而胞外LDH活力则随着hGLP-2浓度的增加而逐渐下降（P＜0.05或0.01）,Caspase-3酶活力极显著（P＜0.01）降低。研究结果表明β-伴球蛋白对断奶仔猪小肠上皮细胞的增殖和细胞完整性有不利影响,而GLP-2能够减轻或者避免β-伴球蛋白对断奶仔猪小肠上皮细胞的增殖和细胞完整性的不利影响,这种效应可能是通过调节细胞Caspase-3的活力而实现的。综上所述,GLP-2可影响断奶仔猪肠粘膜的发育,仔猪肠绒毛高度与GLP-2的分泌变化高度相关;GLP-2在体外可促进断奶仔猪肠上皮细胞增殖,抑制细胞凋（死）亡,这种效应具有明显的剂量依赖关系;使用DPP-Ⅳ抑制剂（KR62436）可以进一步提高GLP-2的作用效果,两者具有明显的协同效应,但单独使用KR62436可能会造成细胞完整性损伤;β-伴球蛋白对断奶仔猪小肠上皮细胞的增殖和细胞完整性有不利影响,而GLP-2能够通过细胞保护作用减轻或者避免β-伴球蛋白对断奶仔猪小肠上皮细胞的增殖和细胞凋亡的不利影响。研究结果为我们进一步探讨GLP-2对断奶仔猪的肠道适应的直接影响及相应的作用机理提高了有力支持,为使用GLP-2调节仔猪断奶应激提供了一个新思路。

全文目录

中文摘要  6-9
Abstract  9-13
符号说明  13-19
前言  19-22
一、文献综述  22-54
  1.GLP-2在机体内的代谢  22-24
    1.1 GLP-2的合成和分泌  22-23
    1.2 GLP-2的降解及清除  23-24
  2.GLP-2的肠道营养作用  24-38
    2.1 对胃肠道强有力的、特异性的营养效果  24-31
      2.1.1 对肠道重量和粘膜形态学的影响  24-27
      2.1.2 刺激肠细胞的增殖、迁移和分化  27-30
      2.1.3 抑制肠细胞凋亡和蛋白质水解  30-31
    2.2 对肠道养分吸收及代谢的影响  31-33
    2.3 降低肠道对大分子物质的通透性,减少细菌移位,抑制炎性细胞因子表达  33-34
    2.4 对机体采食量的调控  34-35
    2.5 GLP-2与肠道疾病的治疗  35-38
  3.GLP-2影响仔猪肠道发育及功能的研究进展  38-51
    3.1 猪GLP-2的代谢特征及生理效应  38-39
    3.2 GLP-2对胎猪、新生仔猪肠道发育的影响  39-43
    3.3 GLP-2影响仔猪的肠道或集体的养分吸收利用  43-45
    3.4 GLP-2在仔猪上发挥作用时的特点及影响因素  45-51
      3.4.1 GLP-2发挥作用的剂量依赖效应  45
      3.4.2 DPP-Ⅳ酶活性的高低及DPP-Ⅳ抑制剂的应用  45-49
      3.4.3 断奶仔猪肠道受到植物抗原攻击时GLP-2的作用  49-51
  4.研究中尚不清楚的几个问题  51-54
    4.1 GLP-2是否与断奶仔猪肠道发育及适应有关  51-52
    4.2 GLP-2与断奶仔猪肠道发育的剂量-效应关系  52
    4.3 使用DPP-Ⅳ抑制剂能否调节GLP-2对断奶仔猪肠细胞的作用效果  52
    4.4 仔猪肠道受到抗原攻击时肠上皮细胞对GLP-2的敏感性  52-53
    4.5 其他尚不清楚的问题  53-54
二、研究方案及目的意义  54-57
  1.研究方案  54-56
    1.1 研究技术路线  54
    1.2 具体方案  54-56
      试验1 不同基因型仔猪断奶前后GLP-2的分泌及与肠道发育的关系  54-55
      试验2 不同浓度GLP-2对28日龄断奶仔猪肠上皮细胞完整性及其增殖的影响  55
      试验3 GLP-2和DPP-Ⅳ抑制剂联合使用对断奶仔猪肠上皮细胞的影响  55
      试验4 GLP-2对β-伴球蛋白损伤的肠上皮细胞的保护、修复作用  55-56
  2.研究目的及意义  56-57
    2.1 研究目的  56
    2.2 研究意义  56-57
三、试验研究内容  57-90
  试验1 不同基因型仔猪断奶前后GLP-2的分泌规律及与肠道发育的关系  57-66
    1.材料与方法  57-59
      1.1 试验动物与分组  57-58
      1.2 试验日粮  58
      1.3 饲养管理  58-59
      1.4 样品采集  59
      1.5 测定指标及测定方法  59
      1.6 数据处理  59
    2.试验结果  59-62
      2.1 小肠发育参数及血清中GLP-2浓度  59-61
      2.2 不同基因型仔猪30日龄小肠绒毛高度与血清GLP-2浓度的相关、回归分析  61-62
    3.讨论  62-65
      3.1 不同基因型仔猪在断奶时效场重量、长度和绒毛高度的差异  62-63
      3.2 不同基因型仔猪断奶前后GLP-2的分泌变化  63-64
      3.3 仔猪在断奶时绒毛发育的形态差异及与GLP-2的关系  64-65
    4.小结  65-66
  试验2 不同浓度GLP-2对28日龄断奶仔猪肠上皮细胞完整性及其增殖的影响  66-67
  试验3 GLP-2和DPP-Ⅳ抑制剂联合使用对断奶仔猪肠上皮细胞的影响  67-79
    1.材料与方法  68-70
      1.1 试验设计  68
      1.2 试验对象  68
      1.3 试验材料  68-69
      1.4 试验方法  69-70
      1.5 实验数据处理  70
    2.结果与分析  70-74
      2.1 DPP-Ⅳ抑制剂对断奶仔猪小肠上皮细胞的影响  70-72
      2.2 GLP-2与DPP-Ⅳ抑制剂联合使用对断奶仔猪小肠上皮细胞的影响  72-74
    3.讨论  74-78
      3.1 DPP-Ⅳ抑制剂(KR62436)对肠道发育及肠上皮细胞的影响  74-75
      3.2 GLP-2和DPP-Ⅳ抑制剂对28日龄断奶仔猪肠上皮细胞的影响  75-76
      3.3 GLP-2和DPP-Ⅳ抑制剂联合利用影响断奶仔猪肠上皮细胞发育的可能机理  76-78
    4.小结  78-79
  试验4 GLP-2对β-伴球蛋白损伤的肠上皮细胞的保护、修复作用  79-90
    1.材料与方法  80-83
      1.1 试验对象  80
      1.2 试验设计  80-81
      1.3 试验材料  81
      1.4 试验方法  81-82
      1.5 实验数据处理  82-83
    2.结果与分析  83-87
      2.1 β-伴球蛋白细胞攻毒模型建立  83-84
        2.1.1 细胞形态观察  83
        2.1.2 β-伴球蛋白对细胞存活、增殖的影响  83-84
        2.1.3 β-伴球蛋白对细胞代谢和细胞完整性的影响  84
      2.2 添加GLP-2对损伤的仔猪肠上皮细胞的影响  84-87
        2.2.1 细胞形态观察  84-85
        2.2.2 GLP-2对致敏细胞存活及增殖的影响  85-86
        2.2.3 hGLP-2对致敏细胞的代谢和完整性的影响  86-87
    3.讨论  87-89
      3.1 β-伴球蛋白对28日龄断奶仔猪肠上皮细胞的影响  87
      3.2 GLP-2对β-伴球蛋白攻毒的28日龄断奶仔猪肠上皮细胞的影响  87-88
      3.3 GLP-2对致敏肠上皮细胞可能的作用机理  88-89
    4.小结  89-90
四、全文讨论  90-98
  1.仔猪断奶前后肠道发省的适应性变化及GLP-2所起的作用  90-92
  2.GLP-2调节断奶仔影响肠上皮细胞增殖、代谢、凋亡的作用特点  92-95
    2.1 GLP-2发挥作用的剂量-效应关系  92-93
    2.2 DPP-Ⅳ抑制剂与GLP-2发挥作用的相互关系  93-94
    2.3 GLP-2在细胞受到致敏性损伤后的细胞保护或修复作用  94-95
  3.使用体外培养的肠上皮细胞研究GLP-2的营养生理效应的利弊  95-98
五、结论  98-100
  1.结论  98
  2.本研究的创新点及有待进一步研究的问题  98-100
参考文献  100-112
致谢  112-113
攻读学位期间发表的学术论文目录  113

胰高血糖素样肽-2与断奶仔猪肠道发育、适应的关系及作用机理研究

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