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microRNA302c在腹膜间皮细胞转分化中的作用及分子机制

作　者: 袁新科
导　师: 肖平
学　校: 中南大学
专　业: 内科学
关键词: 上皮细胞-间充质细胞转分化高糖腹膜透析液 microRNA302c TGF-β1 人腹膜间皮细胞 CTGF
分类号: R692.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景腹膜透析(peritoneal dialysis, PD)是终末期肾脏疾病(end stage renal disease, ESRD)患者最主要的替代治疗之一。研究表明,随着腹透管的改良及置管技术的改进,腹膜炎的发生率显著下降,但长期腹膜透析的病人由于腹膜纤维化,会出现腹膜透析效能的降低,导致超滤衰竭,而逐渐成为了持续性非卧床腹膜透析(continuous ambulatory peritoneal dialysis, CAPD)患者退出的主要原因。TGF-p介导的腹膜纤维化发病机制的研究一直是国内外PD领域研究的重点。近期研究者发现,上皮细胞-间充质细胞转分化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在TGF-p诱导的腹膜纤维化发生起关键的作用[2,3]。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)作为一个促纤维化因子,参与了腹膜纤维化发生的病理生理过程,同时在纤维化的始动过程EMT的发生中也起到重要促进作用[4-6],并且有可能成为抗腹膜纤维化治疗的新靶点。microRNA(miRNA)是存在于动植物基因组中的功能性非编码RNA,长约17～29个核苷酸。目前已鉴定的miRNAs仅占人类基因组序列的1%-3%,却参与1/3基因表达的调控,它在生长发育、细胞分化、增殖、凋亡、肿瘤发生等过程中发挥重要作用。最新的研究报道,miRNAs表达失调与许多疾病相关,且在EMT发展进程中起关键作用。我们高通道miRNA芯片对PD腹膜流出液腹膜间皮细胞miRNA表达进行了图谱分析。发现与腹透开始时相比,许多个miRNA表上调或者下降表达。其中的microRNA302c是以CTGF为下游靶点。提示CTGF在PD腹膜间皮细胞表达增高可能与microRNA302c表达异常有关。基于以上分析,我们认为,microRNA302c参与了调控腹膜间皮细胞EMT及纤维化。第一章microRNA302c在小白鼠腹膜EMT模型腹膜组织中的表达及其与EMT的关系目的利用小鼠腹膜EMT模型,探讨小鼠腹膜组织EMT过程中microRNA302c的表达及其与EMT的关系。方法12周龄ICR雄性小鼠,28-30克。随机分为正常对照组,假手术(sham)生理盐水15天组和30天组,模型4.25%PDS 15天组和30天组。sham组：腹腔注射1.5ml生理盐水,每天一次。模型组：腹腔注射1.5ml含4.25%葡萄糖的标准腹透液,每天一次。按分组于第15天和第30天分别处死小鼠。小鼠脏层腹膜用于提取组织蛋白和mRNA,采用Western-blot、Realtime PCR方法检测microRNA302、zo-l、vimentin、CTGF的表达。结果1.我们前期实验已经证实：随腹腔注射透析液时间延长,假手术组腹膜组织zo-1和vimentin蛋白及mRNA表达变化无统计学意义；而模型组zo-1表达逐渐下降、vimentin表达逐渐增强。提示小鼠腹膜EMT建模成功,生理盐水不能诱导腹膜EMT改变。2. Realtime PCR显示模型组小鼠腹膜组织microRNA302c表达随注射PDS时间的延长逐渐降低。3. Western Blot及Realtime PCR显示,与正常对照组相比,模型组小鼠腹膜组织中zo-1蛋白和mRNA水平随注射PDS时间延长逐渐降低,vimentin、CTGF蛋白和其mRNA表达逐渐增强。4. Linear correlation分析显示,高糖腹膜透析液诱导小鼠腹膜EMT过程中,正常对照组和模型组micro RNA302c表达与CTGF mRNA表达呈负相关；microRNA302c表达与vimentin mRNA表达呈负相关；microRNA302c表达与zo-1mRNA表达呈正相关；CTGF mRNA与vimentin mRNA表达呈正相关；CTGF mRNA与zo-l mRNA表达呈负相关。结论在小鼠腹膜EMT模型中,随EMT进展,腹膜组织的microRNA302c表达显著降低并与EMT、CTGF呈负相关,提示microRNA302c在小鼠腹膜间皮细胞EMT过程中扮演重要角色。第二章microRNA302c在TGF-β1诱导人腹膜间皮细胞EMT中的表达及其与EMT的关系目的探讨microRNA302c在TGF-β1诱导的HPMC EMT中的作用。方法用5ng/ml TGF-β1刺激HPMC,通过Realtime PCR及Western blot检测细胞中microRNA302c及zo-1、vimentin的表达；转染microRNA302c的前体(pre-miR-302c),再予TGF-β1刺激,通过Realtime PCR及Western blot检测HPMC microRNA302c及zo-1、vimentin的表达变化。结果1.5ng/mlTGF-β1刺激后,HPMC microRNA302c表达呈时间依赖性降低,zo-1mRNA及蛋白表达水平呈时间依赖性降低,vimentin mRNA及蛋白表达水平呈时间依赖性升高。2. Realtime PCR结果显示,与对照组相比,TGF-β1组microRNA302c水平明显下调,TGF-β1+pre-miR-302c组microRNA302c表达则较TGF-β1组显著上调(p＜0.05),而与对照组比较无显著性差异(p＞0.05)。3. Realtime PCR与Western blot结果显示与对照组相比,zo-1 mRNA和蛋白表达水平均明显下调,而TGF-β1组vimentin mRNA和蛋白表达水平均明显上调,以上改变在pre-miR-302c+TGF-β1组均被抑制,均有统计学意义。结论TGF-β1诱导HPMC EMT; TGF-β1诱导microRNA302c表达下调；上调microRNA302c可逆转HPMC EMT。第三章microRNA302c通过调节CTGF参与TGF-β1诱导的人腹膜间皮细胞EMT目的探讨microRNA302c参与调控TGF-β1诱导的HPMC EMT的可能机制。方法用5ng/ml TGF-β1刺激HPMC,通过Realtime PCR及Western blot检测细胞中CTGF的表达；转染microRNA302c的前体(pre-miR-302c),再予TGF-β1刺激,通过Realtime PCR及Western blot检测HPMC CTGF的表达变化。结果1.5ng/ml TGF-β1刺激后,HPMC CTGF mRNA及蛋白表达水平呈时间依赖性上调。2. Realtime PCR与Western blot结果显示与对照组相比,TGF-β1组CTGF mRNA和蛋白表达水平均明显上调,以上改变在pre-miR-302c+TGF-β1组被抑制,有统计学意义。结论TGF-β1诱导HPMC CTGF表达上调；microRNA302c通过调节CTGF,影响zo-1、vimentin的表达,从而参与TGF-β1诱导的腹膜间皮细胞EMT。

全文目录

摘要  5-10
ABSTRACT  10-17
第一章 microRNA302c在小鼠腹膜EMT模型腹膜组织中的表达及其与EMT的关系  17-34
  1.1 材料与方法  18-27
  1.2 结果  27-32
  1.3 讨论  32-33
  1.4 小结  33-34
第二章 microRNA302c在TGF-β1诱导人腹膜间皮细胞EMT中的表达及其与EMT的关系  34-48
  2.1 材料与方法  34-39
  2.2 结果  39-46
  2.3 讨论  46-47
  2.4 小结  47-48
第三章 microRNA302c通过调节CTGF参与TGF-β1诱导的人腹膜间皮细胞转分化  48-54
  3.1 材料与方法  48-49
  3.2 结果  49-51
  3.3 讨论  51-53
  3.4 小结  53-54
全文总结  54-55
参考文献  55-59
综述  59-67
  参考文献  64-67
致谢  67-68
攻读学位期间主要研究成果  68

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