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高糖对大鼠肾小球系膜细胞影响的差异蛋白质组学研究

作　者: 刘晖
导　师: 杨方；李平；王献华
学　校: 华北煤炭医学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 高糖肾小球系膜细胞双向凝胶电泳蛋白质组学糖尿病肾病蛋白酶体
分类号: R692
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的:通过对高糖作用下大鼠肾小球系膜细胞蛋白质组学动态变化的观察,了解高糖环境对大鼠肾小球系膜细胞蛋白质成分的影响。方法:1.肾小球系膜细胞的原代培养及鉴定:用分层过滤的方法培养大鼠肾小球系膜细胞,用抗Thy1.1抗体、抗α-SMA抗体、抗广谱Cytokeratin抗体、抗vWF抗体通过免疫细胞化学染色方法鉴定系膜细胞及其纯度。2.将经原代培养后5代的肾小球系膜细胞分别置于含正常糖浓度(NC组含糖5.5mM)、高糖(HG组含糖30mM)的培养基中进行体外培养,分别在0小时、8小时、16小时、72小时、25天,收集细胞,提取细胞总蛋白。运用双向电泳技术对细胞总蛋白进行分离,用胶体考马斯亮蓝染色显示分离结果。3.应用ImageMaster 2D Platinum 6.0双向电泳图像分析软件对2-DE图像进行数字化分析,通过统计学方法评价双向凝胶电泳结果的重复性和可靠性,通过方差不齐t检验获得的p值经FDR校正后p<0.05且该点的volume%值变化超过2倍判断为差异点。4.将凝胶中的差异蛋白点切出,经胶内胰蛋白酶解和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析获得肽质量指纹谱。5.将得到的质谱数据去除胰酶自切峰和角蛋白峰后通过MASCOT数据库检索,按照得分>60分,序列覆盖超过20%,测量分子量与预测分子量相差小于±30%,测得的等电点与预测的等电点相差小于±2.0为标准判定蛋白质。6.利用GoMiner软件依据Gene Ontology(GO)数据库,对鉴定出的蛋白质进行功能分类,利用PUBMED进行蛋白功能查询及结果揭示。结果:1.成功地培养了高纯度的大鼠原代肾小球系膜细胞。培养细胞的免疫细胞化学结果显示系膜细胞特异表达的抗原Thy1.1、α-SMA染色阳性,且阳性率为100%。而对上皮细胞和内皮细胞分别表达阳性的抗原Cytokeratin、vWF系膜细胞则表达阴性,阴性率为100%。2.获得了重复性较好、可信度较高的双向电泳结果。以16小时正常对照组为研究对象,三张胶平均获得了蛋白点965.33±11.37个,810个点在三张胶上均出现,匹配率为84%。三张胶volume%的平均变异系数为17%-18%。3.各个时间点HG组与NC组相比共获得了27个无冗余的差异蛋白质点。高糖组在早期(8小时、16小时)有2个蛋白点表达显著上调,23个蛋白点表达显著下调,中期(72小时)除2个蛋白点表达显著下调外其余各点相比均无统计学意义,而在长期高糖作用下(25天)有2个前期一直稳定表达的蛋白点却发生了明显上调。4.对这27个差异蛋白质点全部获得了质荷比及强度信息。经MASCOT数据库检索,其中26个蛋白点符合前述判断标准,12号和23号点为两种蛋白质的混和物,5和24,15和16号蛋白点分别为相同的蛋白质,可能是由于不同的修饰而造成的不同等电点和分子量的偏移。18号点虽未完全符合上述判断标准但是判断正确的概率较高。5.对除无基因注释的14号及混合物12号和23号外的22种蛋白质,依据GO分类进行了生物信息学分析。高糖环境下的系膜细胞差异表达的蛋白主要定位在胞浆、胞核、细胞骨架、线粒体和内质网上。差异蛋白的分子功能主要和蛋白、核酸、离子结合,以抗氧化活性、氧化还原活性、水解酶活性、异构酶活性为主;主要和细胞信号、细胞周期、凋亡、细胞增殖、细胞碳水化合物代谢过程、DNA代谢过程、RNA代谢过程、蛋白质代谢过程、氧和活性氧代谢过程等生物过程有关。6.通过文献查阅提出了蛋白酶体降解功能的降低,可能在糖尿病肾病发病过程中起着重要作用。结论:通过差异蛋白质组学分析,初步了解了高糖所引起的肾小球系膜细胞蛋白质组的动态表达情况;通过信息生物学分析获得了差异表达蛋白的亚细胞定位、分子功能和主要与其相关的生物学过程。提出了蛋白酶体降解功能降低,可能在糖尿病肾病发病过程中起着重要作用。

全文目录

中文摘要  3-6
英文摘要  6-9
英文缩写  9-11
研究论文  11-73
  前言  11-13
  第一部分大鼠肾小球系膜细胞的原代培养与鉴定  13-28
    材料与方法  13-19
    结果  19-20
    讨论  20-23
    参考文献  23-28
  第二部分高糖对肾小球系膜细胞影响的差异蛋白质组学研究  28-73
    材料与方法  28-42
    结果  42-56
    讨论  56-66
    参考文献  66-73
综述高糖对肾小球系膜细胞影响的分子机制研究进展  73-81
  参考文献  79-81
致谢  81-82
个人简历  82

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