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Ⅰ型神经纤维瘤病基因型小鼠破骨细胞功能及其与骨桥蛋白相关性实验研究

作　者: 李会杰
导　师: 张英泽；杨逢春
学　校: 河北医科大学
专　业: 外科学
关键词: 型神经纤维瘤病破骨细胞骨质疏松小鼠骨桥蛋白骨病变成骨细胞
分类号: R68
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

Ⅰ型神经纤维瘤病是一种常见的起源于神经嵴发育异常的常染色体基因遗传病,其发病率在1:3000。该病的发生是由于神经纤维瘤病基因(NF1)突变引起的。神经纤维瘤病基因已经被确定为一种抑癌基因,它编码的蛋白是Ras-GTP酶激动蛋白(Ras -GAP),被命名为神经纤维瘤病蛋白。神经纤维瘤病蛋白在功能上和结构上都和p120rasGAP同源。GAP蛋白能通过激活Ras活化的GTP结合形式转变成为无活性的GDP结合形式而终止Ras介导信号传导通路。因此,NF1的肿瘤抑制功能被认为主要是依赖它的下调原癌基因ras而实现的。Ras通过MEK/ERK和PI3K传导通路调节细胞的增殖,分化和生存能力。Ⅰ型神经纤维瘤病病人的特征性表现分为肿瘤症状和非肿瘤症状,非肿瘤症状包括高血压,头颅巨大,心脑血管畸形,皮肤皱褶处的间擦型雀斑,智力发育异常,精神症状和骨骼方面的异常。其骨骼病变表现常见的有脊柱侧弯,椎体发育异常,身材短小,蝶骨翼结构异常,胫骨弯曲或假关节形成,局部生长过度,胸廓发育异常,膝内翻,膝外翻,骨囊肿,骨硬化,肋骨融合,髌骨阙如,并指畸形,和一些其他骨的先天畸形,这些骨改变提示神经纤维瘤病基因的突变会引起骨代谢和骨发育的异常。最近有研究表明NF1病人存在明显的骨质疏松和骨量减少。骨组织一直处于自我更新过程中。为了适应骨力学强度及骨代谢平衡的双重需要,骨组织不断被吸收,新骨不断形成并改建。这个过程在骨修复和骨再生时就变得更为活跃。而骨吸收和骨形成是由成骨细胞和破骨细胞之间的平衡来调控的。这两种细胞的平衡一旦被破坏,就会引起骨形成异常,造成骨疾病。成骨细胞来源于间充质干细胞,它的作用是形成新的骨基质。破骨细胞则来源于造血干细胞,其直接前驱细胞又被称为巨噬细胞。在特定的环境下,骨髓中的造血干细胞首先分化成巨噬细胞克隆形成单位(CFU-M)再分化成巨噬细胞,巨噬细胞从骨髓中游离出来,进一步分化成单核破骨细胞。这些单核破骨细胞进而融合成为多核破骨细胞,附着在骨表面,发挥骨吸收作用。Yang等研究表明,Nf1+/-小鼠骨骼中破骨细胞数量明显较野生型小鼠破骨细胞增多,并通过体外培养破骨细胞证明ras通路和PI3K通路活性增强是造成Nf1小鼠破骨细胞功能增强的原因。由于Nf1基因完全敲除的小鼠会在胚胎13天左右因心脏发育异常而死亡,所以不适合用来研究神经纤维瘤病的骨表现。而对Nf1基因杂合型小鼠的研究为研究神经纤维瘤病提供了合适的模型,例如, Nf1+/-小鼠会在出生后第二年自发幼年型粒单核细胞白血病,类似人类神经纤维瘤病病人自然病程中发生恶性肿瘤。Nf1基因半缺失可以造成肥大细胞的增殖,生存能力增强,克隆形成增多,肥大细胞增多症患者有骨质疏松,肥大细胞的增多可能与神经纤维瘤病的骨量减少有关。Nf1基因杂合型上调ras活性,影响细胞功能,已在造血细胞,雪旺细胞,肥大细胞,黑素细胞中证实。骨桥蛋白(Osteopontin)是一种含有Arg-Gly-Asp (RGD)的带负电的非胶原性骨基质糖蛋白,OPN由多种组织细胞合成与分泌,广泛的分布于多种组织和细胞中,包括骨、肾、肌肉、膀胱及自然杀伤细胞。骨细胞、破骨细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞、多种肿瘤细胞及不同成熟阶段的成骨细胞均能合成和分泌OPN分子,OPN具有细胞黏附蛋白和细胞因子的双重作用,它通过与细胞表面的整合素(integrin)如αvβ3、αvβ1、αvβ5、α4β1、α9β1和CD44结合,通过RGD序列结合于细胞表面,从而介导细胞-细胞、细胞-基质的相互作用,传导细胞外信号。CD44作为OPN的受体,在雪旺细胞与神经突黏附、雪旺细胞凋亡及完成信号传导方面有重要作用,这也提示了OPN在Nf1的发病机制中发挥一定作用。在破骨细胞骨吸收过程中,OPN与破骨细胞膜上结合,激发αvβ3钙调素相关的钙泵从而促进破骨细胞极化。破骨细胞膜上αvβ3结合可以引起酪氨酸激酶的活化,从而使破骨细胞形成皱褶缘,促进破骨细胞的骨吸收作用。Taeko Ishii通过对关节炎模型小鼠破骨细胞的研究,发现在关节炎模型小鼠的破骨细胞培养液中OPN含量明显增多,给与OPN中和抗体可明显抑制关节炎小鼠破骨细胞的功能,并证明OPN可增加基质细胞的RANKL的分泌,从而刺激破骨细胞功能增强。本实验研究了1型神经纤维瘤病小鼠模型的破骨细胞功能变化以及骨桥蛋白在其中的作用,并为治疗提供思路。第一部分1型神经纤维瘤病基因型小鼠的破骨细胞功能研究目的:研究?型神经纤维瘤病基因型小鼠的破骨细胞功能变化,探讨?型神经纤维瘤病引起骨质疏松的发病机制。方法:选取神经纤维瘤病基因杂合型(Nf1+/-)和野生型(Nf1+/+)小鼠为研究对象,取胫骨干骺端行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色,比较两组小鼠骨内破骨细胞含量,并进行统计学分析。体外实验取两种基因型小鼠的骨髓单核细胞,观察在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF, macroPhage colony-stimulating factor)和细胞核因子κB受体活化因子配基(RANKL, receptor activator of NF-κB ligand)诱导下的破骨细胞分化能力,测定两组破骨细胞形成、分化、贴附、迁移和骨吸收功能,并进行统计学比较。结果: Nf1+/-小鼠骨内成熟破骨细胞数量比Nf1+/+增多,细胞体积明显增大, ( TRAP阳性区面积占总面积的百分比分别为Nf1+/+, 0.88%±0.0014; Nf1+/-, 2.33%±0.0013,P<0.01)有显著性差异;体外培养的Nf1+/-破骨细胞形成增多,(每1×105骨髓单核细胞形成的破骨细胞数分别为Nf1+/+,41.75±13.14 ; Nf1+/-, 61.17±18.17, P<0.01)与Nf1+/+有显著性差异;体外诱导培养的Nf1+/-破骨细胞的粘附、迁移、骨吸收功能强(粘附细胞数量Nf1+/+,53±11.08; Nf1+/-,108±11.67, P<0.01;迁移细胞数量Nf1+/+,88.33±12.40; Nf1+/-,239.83±67.77, P<0.01;骨吸收面积百分比Nf1+/+,18.37%±0.0367; Nf1+/-, 40.44,%±0.1052, P<0.01)二者有显著性差异。结论:破骨细胞形成增多,功能增强是?型神经纤维瘤病引起骨质疏松的发病机制之一。第二部分外源性骨桥蛋白对1型神经纤维瘤病小鼠破骨细胞功能影响目的:研究外源性骨桥蛋白对?型神经纤维瘤病基因型小鼠的破骨细胞功能的影响,探讨?型神经纤维瘤病破骨细胞功能增强,引起骨改变的发病机制。方法:选取神经纤维瘤病基因杂合型(Nf1+/-)和野生型(Nf1+/+)小鼠为研究对象,取小鼠的骨髓基质细胞,在一定M-CSF和RANKL的刺激下向破骨细胞分化,并给与外源性骨桥蛋白,研究测定两组破骨细胞形成、分化、黏附、迁移和骨吸收功能,并进行统计学比较。结果:经三次以上独立的实验结果统计,在骨桥蛋白的作用下Nf1+/-基因型小鼠破骨细胞的形成、分化、黏附、迁移、和骨吸收功能强于Nf1+/+基因型小鼠,破骨细胞形成(Trap+细胞计数Nf1+/+不加OPN 39.25±11.9加入OPN 47±2.34;Nf1+/-不加OPN 51.5±5.90加入OPN 70.75±0.81, p<0.05 )黏附功能(黏附细胞数Nf1+/+不加OPN 52.20±11.79,加入OPN,69.80±7.65;Nf1+/-不加OPN 80.40±13.61,加入OPN 162.50±10.52, p<0.05),迁移功能(迁移细胞计数Nf1+/+不加OPN 87.20±5.17,加入OPN 238.17±28.20 ; Nf1+/-不加OPN 223.17±29.02 ,加入OPN 582.13±51.51, p<0.05),骨吸收能力(骨吸收面积百分比Nf1+/+不加OPN 4.18%±0.0011加入OPN 17.08%±0.018;Nf1+/-不加OPN 9.11%±0.008,加入OPN 72.14%±0.083, p<0.05),二者有显著性差异。结论:骨桥蛋白诱导的破骨细胞功能增强是?型神经纤维瘤病骨改变的发病机制之一,骨桥蛋白是治疗?型神经纤维瘤病骨改变的候选靶向分子。第三部分Nf1+/-小鼠破骨细胞自分泌骨桥蛋白在其破骨细胞功能增强中的作用目的:研究体外培养的Nf1+/-小鼠破骨细胞的分泌合成骨桥蛋白的能力,应用骨桥蛋白中和抗体抑制破骨细胞分泌的骨桥蛋白,并与野生型破骨细胞比较,分析骨桥蛋白在Nf1+/-小鼠破骨细胞功能增强中的作用。方法:采取体外培养的Nf1+/-小鼠破骨细胞不同时期的上清液,做ELISA分析检测OPN浓度,并与Nf1+/+破骨细胞比较;在加入OPN中和抗体的条件下,测定体外培养的Nf1+/-小鼠破骨细胞的形成及迁移、粘附、骨吸收能力,并与Nf1+/+破骨细胞比较。结果:在体外培养的Nf1+/-小鼠破骨细胞上清液中,OPN含量比野生型小鼠破骨细胞上清液中含量明显增高,与培养3天的破骨细胞上清液相比,培养6天的破骨细胞上清液中OPN含量的差别更为明显,(Nf1+/+ 3天,54.60±6.72ng/ml;6天,80.04±11.11ng/ml;Nf1+/-3天,71.34±9.18ng/ml, 6天,120.73±3.4ng/ml p<0.05)二者有显著性差异。在体外培养破骨细胞时加入有活性的OPN中和抗体,可以抑制Nf1+/-破骨细胞的形成, (Trap+细胞数Nf1+/+无OPN抗体42.0±6.08加入OPN抗体34.67±6.23;Nf1+/-无OPN抗体72.33±5.75加入OPN抗体41.67±11.86, p<0.01)二者有显著性差异。贴附功能(贴附细胞数Nf1+/+无OPN抗体39.25±11.9加入OPN抗体27±2.34;Nf1+/-无OPN抗体51.5±5.90加入OPN抗体10.75±0.81, p<0.01)二者有显著性差异。迁移功能(迁移细胞数Nf1+/+无OPN抗体150.20±35.28加入OPN抗体114.8±24.05 ; Nf1+/-无OPN抗体241.60±37.10加入OPN抗体111.80±21.13, p<0.01)二者有显著性差异。骨吸收功能(骨吸收面积百分比Nf1+/+无OPN抗体4.18%±0.0011加入OPN抗体2.08%±0.0041;Nf1+/-无OPN抗体19.11%±0.046加入OPN抗体1.81%±0.002, p<0.01)二者有显著性差异。结论:自分泌骨桥蛋白在Nf1+/-小鼠破骨细胞功能增强过程中发挥重要作用,OPN是治疗神经纤维瘤病骨质疏松的靶向治疗候选靶分子之一。第四部分Nf1+/-小鼠成骨细胞旁分泌骨桥蛋白在破骨细胞功能增强中的作用目的:研究体外培养的Nf1+/-小鼠成骨细胞的分泌合成骨桥蛋白的能力,应用骨桥蛋白中和抗体抑制成骨细胞分泌的骨桥蛋白,并与破骨细胞共同培养,分析成骨细胞旁分泌骨桥蛋白在Nf1+/-小鼠破骨细胞功能增强中的作用。方法:采取体外培养的Nf1+/-小鼠成骨细胞的上清液,做ELISA分析检测OPN浓度,并与Nf1+/+破骨细胞比较;在加入OPN中和抗体的条件下,测定加入Nf1+/-成骨细胞条件培养液体外培养的小鼠破骨细胞的形成及迁移、粘附、骨吸收能力,并与Nf1+/+破骨细胞比较。结果:在体外培养的Nf1+/-小鼠成骨细胞条件培养液中,OPN含量比野生型小鼠成骨细胞细胞条件培养液中含量明显增高。(Nf1+/+141.09±11.31ng/ml;Nf1+/-241.08±18.63ng/ml, p<0.01)二者有显著性差异。在体外培养破骨细胞时加入成骨细胞条件培养液,可促进破骨细胞形成,功能增强,以Nf1+/-小鼠成骨细胞条件培养液作用更明显。同时加入有活性的OPN中和抗体,可以抑制Nf1+/-成骨细胞条件培养液促进破骨细胞的形成的作用,二者有显著性差异。结论:成骨细胞旁分泌骨桥蛋白在Nf1+/-小鼠破骨细胞功能增强过程中发挥重要作用,OPN是治疗神经纤维瘤病骨质疏松的靶向治疗候选靶分子之一。

全文目录

摘要  5-11
ABSTRACT  11-17
英文缩写  17-18
I 型神经纤维瘤病基因型小鼠破骨细胞功能及其与骨桥蛋白相关性实验研究  18-80
  引言  18-20
  第一部分 I型神经纤维瘤病基因型小鼠的破骨细胞功能研究  20-34
    前言  20-21
    材料与方法  21-25
    附图  25-30
    讨论  30-31
    小结  31-32
    参考文献  32-34
  第二部分骨桥蛋白对I 型神经纤维瘤病小鼠破骨细胞功能影响  34-45
    前言  34
    材料与方法  34-37
    附图  37-41
    讨论  41-42
    小结  42-43
    参考文献  43-45
  第三部分 NF1+/-小鼠破骨细胞自分泌骨桥蛋白在其破骨细胞功能增强中的作用  45-60
    前言  45-47
    材料与方法  47-49
    结果  49-50
    附图  50-55
    讨论  55-57
    小结  57
    参考文献  57-60
  第四部分 PARACRINE SECRETION OF OSTEOPONTIN BY NF1+/- OSTEOBLASTS PROMOTE OSTEOCLAST ACTIVATION IN A NEUROFIBROMATOSIS TYPE I MURINE MODEL  60-80
    INTRODUCTION  60-62
    MATERIALS AND METHODS  62-65
    RESULTS  65-67
    Figures  67-73
    DISCUSSION  73-74
    REFERENCES  74-80
综述一骨桥蛋白及其对破骨细胞的作用研究进展  80-95
综述二 1型神经纤维瘤病临床及发病机制新进展  95-107
致谢  107-108
个人简历  108-109

Ⅰ型神经纤维瘤病基因型小鼠破骨细胞功能及其与骨桥蛋白相关性实验研究

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