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桃核发育的生理生化特性及基因表达差异研究

作　者: 杨爱珍
导　师: 张志毅；王有年
学　校: 北京林业大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: 桃果实 内果皮发育 代谢 荧光定量 蛋白质组学
分类号: S664.1
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
下　载: 349次
引　用: 3次
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内容摘要


北京市平谷区‘久保’和‘京玉’桃果实,几年来因其味美个大、外观漂亮,深受市场欢迎。但近几年,桃核开裂,引起微生物入侵,造成品质降低,为了解决这一难题,本论文对桃果实内果皮发育过程进行了系统地研究。以上述这两个桃品种为试材,应用间苯三酚-HCl对桃果实内果皮木质素进行染色,观察木质素沉积进程;应用透射电镜观察内果皮PCD(programmed cell death,细胞程序性死亡)进程中细胞结构的变化;测定木质素代谢相关酶(PAL、C4H和CAD)活性、不同部位(叶片、韧皮部、中果皮和内果皮)糖分含量及其代谢酶活性的变化;通过气质联用色谱,检测种子、内果皮和中果皮三个部位IAA、ABA的含量;应用分子生物学手段,检测开裂相关基因SPT和IND的表达水平;应用蛋白质组学方法初步研究中、内果皮发育中蛋白质点数的差异。主要研究内容及结果如下:1.观察了桃果实内果皮木质化过程中木质素沉积的进程及细胞器的动态变化。桃果实内果皮木质化过程中,从外观上观察,木质素先出现在内果皮里面,由内而外逐渐沉积;从细胞水平上看,是以颗粒状方式沉积,开始少量出现在胞间层及细胞角隅处,随后大量出现在次生壁上。在此沉积过程中,有丰富的高尔基体、内质网、线粒体等细胞器出现,其中线粒体降解最迟。2.研究了桃果实内果皮木质化PCD进程及与降解酶之间的关系。桃果核在发育前期,有明显的细胞器结构变化,DAFB 14天,叶绿体明显;但在DAFB(days after full bloom,盛花后天数)21天时,叶绿体已基本消失;到DAFB35天后木质素前体物质积累较多,细胞有可能进入不可逆地PCD过程,细胞色素C大量地从线粒体释放(用免疫胶体金原位杂交),并有凋亡小体的形成(用TUNEL方法检测);到DAFB 45天时,部分细胞次生壁沉积完毕,整个细胞所有细胞器和内含物都自溶,细胞成为中空的木质化细胞。蛋白酶与RNA酶活性上升;DNA酶较RNA酶提早进入高峰期。3.分析了桃果实发育中中果皮和内果皮糖积累量的分配及其酶活性的变化。桃果实发育前期(盛花后8-16天),幼叶的生长发育主要通过韧皮部来提供营养,中、内果皮的分裂分化主要通过子房或自身来获得营养。在‘京玉’桃品种中,DAFB24天,库(内果皮+中果皮)中山梨醇含量占韧皮部的92%(卸载率),其中内果皮占41%,中果皮占51%;DAFB 40天,韧皮部卸载率降到61%,其中内果皮占32%,中果皮占29%;到56天,韧皮部的卸载率降到32%,其中内果皮占4%,中果皮占28%,说明有很少光合产物运输到内果皮;到盛花后80天,韧皮部卸载率升到51%,一直持续到104天之后。由此说明,桃果实韧皮部的卸载率与库的代谢强弱有很大的相关性,中、内果皮的光合同化物的分配率与生长期有关。山梨醇代谢酶活性与中、内果皮可溶性总糖有关:蔗糖分解酶活性与中、内果皮葡萄糖和果糖高峰有关。山梨醇代谢酶与蔗糖代谢酶活性高峰都集中在桃果实增重期,‘库’代谢的强弱影响‘源’的光合力和运输力。4.进行了桃果实内果皮木质化过程中SPT和IND基因相对表达量分析及蛋白质组学初步的研究。桃果实内果皮木质化过程中,中果皮和内果皮IAA含量的变化曲线类似于SPT和IND基因相对表达量的变化,都是在DAFB 35天出现高峰,说明这两基因的表达量都与IAA有关,但与ABA相关性似乎较低。应用蛋白组学方法表明,随着发育的进程内果皮蛋白质点数越来越低,中果皮蛋白质点数明显低于内果皮蛋白质点数,说明内果皮有更复杂的代谢过程。5.分析了桃果实裂核的可能原因。桃核细胞角隅处没有木质素的沉积有可能是自身裂核的潜在原因;前期糖分积累不足有可能导致木质化程度不够,造成容易裂核。所以建议在前期通过叶面喷施糖分有可能减低裂核。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-9
目录  9-16
1 文献综述  16-42
  1.1 木质素沉积及合成代谢的研究进展  16-20
    1.1.1 木质素在植物组织及细胞壁中的沉积及机理  16-17
    1.1.2 木质素代谢与细胞分化  17-19
    1.1.3 木质素代谢与植物生长发育的关系  19
    1.1.4 木质素代谢与植物抗病性  19-20
  1.2 植物PCD的研究进展  20-27
    1.2.1 植物PCD的形态学和生物化学特征  21-22
    1.2.2 植物中PCD的存在部位  22-23
    1.2.3 植物在抗病和逆境中存在的PcD  23
    1.2.4 植物PCD的检测方法  23-25
    1.2.5 植物PCD涉及的细胞器  25
    1.2.6 植物衰老与PCD的关系  25-26
    1.2.7 植物细胞凋亡研究的意义  26-27
  1.3 糖积累与代谢的研究进展  27-35
    1.3.1 果实糖分源库卸载及积累过程  27-28
    1.3.2 果实内糖分代谢相关酶  28-31
      1.3.2.1 蔗糖代谢酶的调节  28-30
      1.3.2.2 山梨醇代谢酶的调节  30-31
    1.3.3 果实糖分积累与代谢的分子生物学研究  31-33
      1.3.3.1 蔗糖积累与代谢的分子生物学研究  31-32
      1.3.3.2 果糖积累的分子生物学调控  32-33
      1.3.3.3 山梨醇代谢及积累的分子生物学研究  33
    1.3.4 影响糖分积累及代谢的其他相关因子  33-35
      1.3.4.1 自然环境对果实糖代谢与积累的影响  33-34
      1.3.4.2 栽培措施对果实糖代谢与积累的影响  34
      1.3.4.3 糖、激素作为信号分子对糖代谢的影响  34-35
  1.4 植物开裂基因的研究进展  35-39
    1.4.1 调控开裂区(the dehiscence zone,DZ)细胞分化的相关基因  35-37
      1.4.1.1 MADS盒基因  35-36
      1.4.1.2 编码bHLH蛋白家族的基因  36-37
      1.4.1.3 上述各基因之间的关系  37
    1.4.2 调控DZ中间薄片层开裂的基因  37
    1.4.3 激素对植物果实发育与脱落的影响  37-39
  1.5 蛋白质组学在园艺植物学上的应用  39-40
  1.6 桃果实内果皮发育的研究  40
  1.7 本研究的目的意义  40-42
2 桃果实内果皮木质素沉积进程及代谢酶活性的变化  42-55
  2.1 试验材料与方法  42-45
    2.1.1 试验材料  42
    2.1.2 实验方法  42-45
      2.1.2.1 木质素沉积的检测  42
      2.1.2.2 透射电镜方法  42-43
      2.1.2.3 木质素含量及代谢酶活性的测定方法  43-45
  2.2 结果与分析  45-52
    2.2.1 桃果实发育过程中内果皮木质素沉积的进程  45
    2.2.2 桃果实发育中内果皮木质素在细胞壁沉积的变化  45
    2.2.3 桃果实发育中内果皮细胞黑色聚合体在细胞壁沉积的进程  45-47
    2.2.4 桃果实发育中内果皮木质素含量的变化  47-49
    2.2.5 桃果实发育中内果皮PAL和C4H活性的变化  49-51
    2.2.6 桃果实发育中内果皮CAD和POD活性的变化  51-52
  2.3 讨论  52-54
    2.3.1 木质素沉积过程中细胞器的动态变化及沉积过程的研究  52-53
    2.3.2 PAL、C4H和CAD对桃果实内果皮木质素沉积的影响  53-54
    2.3.3 POD对桃果实内果皮木质素沉积的影响  54
  2.4 小结  54-55
3 桃果实内果皮发育中细胞形态及蛋白和核酸酶活性的变化  55-65
  3.1 试验材料与方法  55-57
    3.1.1 试验材料  55
    3.1.2 试验方法  55-57
      3.1.2.1 透射电镜样品制备  55
      3.1.2.2 TUNEL实验的检测  55
      3.1.2.3 细胞色素C免疫胶体金的测定方法  55
      3.1.2.4 蛋白含量测定  55-56
      3.1.2.5 蛋白酶活性的测定  56
      3.1.2.6 核酸水解酶活性的测定  56-57
  3.2 结果与分析  57-63
    3.2.1 桃果实发育中内果皮细胞透射电镜的观察  57
    3.2.2 桃果实发育中内果皮细胞TUNEL实验的检测  57
    3.2.3 桃果实发育中细胞色素C的免疫胶体金定位  57-59
    3.2.4 桃果实发育中内果皮可溶性蛋白质含量的变化  59-62
    3.2.5 桃果实发育中内果皮蛋白酶活性的变化  62
    3.2.6 桃果实发育中核酸酶活性的变化  62-63
  3.3 讨论  63-64
    3.3.1 桃果实内果皮发育中PCD的形态结构及其相关酶活性的变化  63-64
    3.3.2 桃果实内果皮发育中细胞器的变化  64
  3.4 小结  64-65
4 桃果实内果皮发育中糖代谢变化的研究  65-81
  4.1 试验材料与方法  65-67
    4.1.1 试验材料  65
    4.1.2 试验方法  65-67
      4.1.2.1 可溶性糖的提取与测定  65-66
      4.1.2.2 酶的提取与测定  66-67
  4.2 结果与分析  67-76
    4.2.1 桃果实发育中单果重含量的变化  67-68
    4.2.2 桃果实发育中山梨醇和蔗糖在叶片和韧皮部中含量的变化  68-69
    4.2.3 桃果实发育中山梨醇和蔗糖在内果皮和中果皮中含量的变化  69
    4.2.4 桃果实发育中可溶性总糖在叶片和韧皮部中含量的变化  69-70
    4.2.5 桃果实发育中可溶性总糖在内果皮和中果皮中含量的变化  70-71
    4.2.6 桃果实发育中葡萄糖和果糖在叶片和韧皮部中含量的变化  71
    4.2.7 桃果实发育中葡萄糖和果糖在内果皮和中果皮中含量的变化  71-72
    4.2.8 桃果实发育中蔗糖合成酶活性在叶片和韧皮部的变化  72-73
    4.2.9 桃果实发育中蔗糖合成酶活性在内果皮和中果皮的变化  73
    4.2.10 桃果实发育中蔗糖分解酶活性在叶片和韧皮部的变化  73-74
    4.2.11 桃果实发育中蔗糖分解酶活性在内果皮和中果皮的变化  74-75
    4.2.12 桃果实发育中山梨醇代谢酶在叶片和韧皮部中活性的变化  75-76
    4.2.13 桃果实发育中山梨醇代谢酶在内果皮和中果皮活性的变化  76
  4.3 讨论  76-79
    4.3.1 桃树果实发育中不同源库之间光合产物的分配  76-77
    4.3.2 桃树果实发育中蔗糖代谢酶对糖在内果皮积累的影响  77-79
    4.3.3 桃树果实发育中山梨醇代谢酶对糖积累的影响  79
    4.3.4 桃果实内果皮木质化过程中糖积累的变化  79
  4.4 小结  79-81
5 桃果实发育中激素含量与SPT和IND基因实时荧光PCR相对表达量的变化  81-93
  5.1 试验材料与方法  81-83
    5.1.1 试验材料  81
    5.1.2 试验方法  81-83
      5.1.2.1 激素测定方法  81-82
      5.1.2.2 SPT和IND基因荧光定量PCR方法  82-83
  5.2 结果与分析  83-91
    5.2.1 桃果实内果皮发育中种子基部和顶部IAA含量的变化  83
    5.2.2 桃果实内果皮发育中种子基部和顶部ABA含量的变化  83
    5.2.3 桃果实内果皮发育中内果皮基部和顶部IAA含量的变化  83-84
    5.2.4 桃果实内果皮发育中内果皮基部和顶部ABA含量的变化  84-85
    5.2.5 桃果实内果皮发育中中果皮基部和顶部IAA含量的变化  85
    5.2.6 桃果实内果皮发育中中果皮基部和顶部ABA含量的变化  85
    5.2.7 桃果实发育中SPT基因与IND基因荧光定量PCR检测  85-91
      5.2.7.1 桃果实中RNA提取及检测结果  85
      5.2.7.2 桃果实中SPT和IND基因引物设计及片段的克隆  85-86
      5.2.7.3 桃果实中SPT和IND基因的克隆片段比对结果  86-89
      5.2.7.4 桃果实中SPT和IND基因引物合成及扩增片段质量检测  89
      5.2.7.5 桃果实中ACTIN、SPT和IND基因实时荧光定量PCR扩增曲线  89-91
      5.2.7.6 桃果实发育中SPT和IND基因荧光定量PCR相对表达量  91
  5.3 讨论  91-92
    5.3.1 桃果实发育中种子、中果皮和内果皮不同部位激素间的关系  91-92
    5.3.2 桃果实发育中激素与SPT和IND基因表达量间的关系  92
  5.4 小结  92-93
6 桃果实发育中果皮蛋白质双向电泳图谱测定  93-99
  6.1 试验材料与方法  93-96
    6.1.1 试验材料  93
    6.1.2 试验方法  93-96
      6.1.2.1 样品蛋白质的提取  93
      6.1.2.2 样品蛋白质的溶解  93
      6.1.2.3 IPG胶条的水化与第一向等电聚焦的操作  93
      6.1.2.4 第二向SDS-PAGE电泳  93-94
      6.1.2.5 银染色  94
      6.1.2.6 凝胶图像的采集  94
      6.1.2.7 胶内酶解  94
      6.1.2.8 质谱分析  94-96
  6.2 结果与分析  96-97
    6.2.1 ‘久保'桃果实内果皮和中果皮双向电泳图谱及蛋白点数的比较  96
    6.2.2 ‘久保'桃果实木素代谢相关酶质谱鉴定结果分析  96-97
  6.3 讨论  97-98
    6.3.1 中果皮与内果皮蛋白质点数的差异比较  97-98
    6.3.2 中果皮和内果皮质谱结果与基因功能的初步分析  98
  6.4 小结  98-99
7 结论与展望  99-102
  7.1 结论  99-100
  7.2 展望  100-102
参考文献  102-115
个人简介  115-116
导师简介1  116-117
导师简介2  117-118
致谢  118

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 坚果类（壳果类） > 核桃（胡桃）
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