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霍山石斛的分子分类、NO生理调节作用研究及FPS基因的克隆

作　者: 樊洪泓
导　师: 林毅
学　校: 安徽农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 霍山石解 分子标记 一氧化氮 强光胁迫 叶绿素荧光参数 法呢基焦磷酸合酶 基因克隆
分类号: S567.239
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


石斛属（Dendrobium）植物是兰科多年生附生植物、兼性CAM植物,为名贵中药材。其中近40种可以入药,但不同种类石斛药用成分及含量差异较大,药理活性也不尽相同。传统的系统分类和进化研究,主要依据形态学和地理分布,得到的结论不一致,易引起争论。目前,已有多种分子标记方法应用于石斛属植物的遗传多样性及亲缘关系的研究,但序列相关扩增多态性（SRAP）分子标记技术在该属植物中的应用鲜见报道。霍山石斛（D.huoshanense）是安徽省霍山县的特有石斛,属药用石斛中的特级珍品,是国家重点保护的药用植物和名贵中药材。由于其生境独特,繁殖困难,加之过度采收,野生资源已濒临绝迹。为增加其药源,前人在霍山石斛人工栽培、组织培养快繁方面做了大量研究工作,但对其生理代谢的调控、关键酶基因的克隆以及利用基因工程的方法调节功能基因表达的研究较少。一氧化氮（nitric oxide,NO）作为植物体一种新的信号分子,参与植物许多生理代谢的调节和次生代谢产物合成调控,而且可以作为胁迫响应的关键信使。但NO对霍山石斛这种兼性CAM植物生理代谢调节的研究未见报道。本课题利用两种分子标记技术分析药用石斛的遗传多样性及亲缘关系,确立属下分类系统,为更好地开发利用药用石斛资源奠定基础。同时,本课题以霍山石斛为材料,研究在逆境与非逆境条件下NO对霍山石斛的生理调节作用,为了解NO对兼性CAM植物生理代谢的调节提供理论依据。此外,本研究还通过基于同源性的RT-PCR方法,克隆霍山石斛倍半萜类物质合成途径中的关键酶法呢基焦磷酸合酶基因（FPS）,为进一步利用基因工程调控霍山石斛生物碱合成提供基础。主要研究结果如下:1.利用SRAP和RAPD两种分子标记技术,研究霍山石斛与其它药用石斛主要产区代表性石斛的亲缘关系。试验以用36个RAPD引物和40个SRAP引物组合分别对9个供试石斛的基因组DNA进行扩增。RAPD引物共产生281条带,多态性带占87.09%,遗传相似性系数在0.4942～0.7731之间;SRAP引物组合共产生1977条带,多态性带占90.2%,遗传相似性系数在0.3302～0.7892之间。基于两种标记的聚类结果存在一定的差异,SRAP聚类结果能较好地体现供试品种的亲缘关系、地域特性和树型特点,与传统的基于形态特征建立的分类结果比较一致。相对而言,SRAP比RAPD可检测到更高的遗传变异、更大的标记效率和较高的多样性检测能力。2.以不同浓度的SNP处理霍山石斛野生苗和试管苗,研究外源NO对霍山石斛膜脂过氧化和抗氧化系统的影响,筛选了0.1mmol·L-1和0.5mmol·L-1SNP作为霍山石斛野生苗的处理浓度,而0～75μmol·L-1SNP为霍山石斛试管苗的适宜处理浓度。进一步研究表明,（1）强光胁迫下,0.1mmol·L-1SNP处理增强了霍山石斛野生苗的SOD、POD和CAT三种酶活,提高了抗氧化系统清除活性氧能力,膜脂过氧化程度减轻,缓解了强光的胁迫作用,而0.5mmol·L-1SNP处理后,霍山石斛的SOD、POD和CAT的活性降低,丙二醛含量升高,SNP处理加剧了强光胁迫造成的氧化损伤。（2）以SNP处理霍山石斛试管苗发现,在0～50μmol·L-1SNP处理浓度间,随着SNP浓度的提高,霍山石斛的叶绿素含量、可溶性蛋白、苯丙氨酸解氨酶活和生物碱含量均呈现出逐步的递增,NO可诱导霍山石斛次生代谢产物的合成积累。作为诱导子,50μmol·L-1SNP是处理霍山石斛试管苗的适宜浓度。3.总结了强光胁迫下霍山石斛光抑制的生理变化,研究了外源NO在光抑制及暗恢复中的作用。试验采用“lake model”和“puddle model”两种模式,对800μmol·m-2·s-1光强下的霍山石斛叶绿素荧光参数进行了测定。800μmol·m-2·s-1光强下,霍山石斛的Fv/Fm、ΦpsⅡ、qP、qL、NPQ、ΦNPQ、ETR显著下降,ΦNO显著上升,PSⅡ反应中心已不能通过有效调控对过剩光能进行耗散,霍山石斛发生严重的光抑制;暗恢复24h后,霍山石斛的Fv/Fm、ΦpsⅡ、qP、qL、NPQ、ΦNPQ、ETR上升,PSⅡ反应中心逐渐恢复。通过两种模式下叶绿素荧光参数的比较发现,“lake model”更能简单有效的反映霍山石斛的光能转换系统的运转状态。强光胁迫下,0.1mmol·L-1SNP处理提高了石斛PSⅡ的光能转换效率和潜在活性,增加了过剩光能的非光化学耗散,缓解了光抑制的发生,有效保护了光合机构免受强光胁迫的伤害,PSⅡ反应中心得以较快恢复。而经0.5mmol·L-1SNP处理后,霍山石斛的光能转换系统未能通过有效的光能转换和非光化学反应耗散过剩的光能,加剧了PSⅡ反应中心光抑制的发生。4.以霍山石斛为材料,根据在GenBank已登录的其它植物法呢基焦磷酸合酶基因的氨基酸序列,设计简并引物,利用RT-PCR技术,克隆出了石斛FPS基因片段（GenBank登录号:EU681273）,sh-fps的cDNA序列长为522bp,编码174个氨基酸。sh-fps推断的氨基酸序列与多种植物FPS基因的氨基酸序列具有较高的同源性,同源性为79%-88%,且该基因片段在推测的氨基酸序列中含有FPS基因家族中高度保守的、与其活性有关的2个特异性的富含天冬氨酸的区段。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-11
专用名词缩略表  11-13
第一章 文献综述  13-31
  1 石斛属植物的研究进展  13-21
  2 霍山石斛的研究进展  21-24
  3 植物NO的研究进展  24-31
引言  31-33
  1.立论依据及意义  31-32
  2.研究内容  32-33
第二章 石斛属植物遗传多样性的SRAP和RAPD比较分析  33-52
  1.材料与方法  33-37
    1.1 材料和试剂  33-35
    1.2 总DNA的提取及质量检测  35
    1.3 SRAP-PCR扩增和产物检测  35-36
    1.4 RAPD-PCR扩增和产物检测  36
    1.5 数据处理与分析  36-37
  2.结果与分析  37-48
    2.1 总DNA的质量检测  37-38
    2.2 SRAP-PCR反应体系优化与引物筛选  38-41
    2.3 SRAP和RAPD分析揭示石斛的多态性  41-43
    2.4 供试材料的遗传相似性和聚类分析  43-46
    2.5 RAPD和SRAP标记的标记效率分析  46-48
    2.6 RAPD与SRAP标记的相关分析  48
  3.讨论  48-50
    3.1 SRAP和RAPD分析石斛遗传多样性的比较  48
    3.2 SRAP和RAPD聚类结果的差异分析  48-49
    3.3 SRAP和RAPD在石斛种质资源研究中的应用  49-50
  4.小结  50-52
第三章 外源NO对霍山石斛生理代谢的影响  52-67
  1.材料与方法  52-56
    1.1 植物材料  52-53
    1.2 仪器和试剂  53-54
    1.3 测定项目与方法  54-56
    1.4 数据的处理与分析  56
  2.结果与分析  56-64
    2.1 霍山石斛SNP处理适宜浓度的确定  56-59
    2.2 外源NO对霍山石斛野生苗生理代谢的影响  59-62
    2.3 外源NO对霍山石斛试管苗生理代谢的影响  62-64
  3.讨论  64-66
    3.1 SNP处理浓度的选择  64-65
    3.2 外源NO对霍山石斛野生苗膜脂过氧化和抗氧化系统的影响  65
    3.3 NO对霍山石斛试管苗次生代谢产物积累影响  65-66
  4.小结  66-67
第四章 强光胁迫和外源NO对霍山石斛叶绿素荧光参数的影响  67-79
  1.材料与方法  67-69
    1.1 植物材料与处理  67-68
    1.2 仪器和试剂  68
    1.3 测定项目及方法  68-69
    1.4 数据的处理与分析  69
  2.结果与分析  69-76
    2.1 强光胁迫和外源NO对霍山石斛初始荧光Fo、Fm和Ft的影响  69-71
    2.2 强光胁迫和外源NO对霍山石斛PSⅡ潜在光化学效率的影响  71-72
    2.3 强光胁迫和外源NO对霍山石斛"puddlemodel"叶绿素荧光参数的影响  72-74
    2.4 强光胁迫和外源NO对霍山石斛"lakemodel"叶绿素荧光参数的影响  74-76
  3.讨论  76-78
    3.1 强光胁迫对霍山石斛叶绿素荧光参数的影响  76
    3.2 外源NO对霍山石斛光能吸收转换的影响  76-77
    3.3 "lakemodel"和"puddlemodel"在石斛叶绿素荧光研究中的应用  77
    3.4 霍山石斛光抑制与生产力  77-78
  4.小结  78-79
第五章 石斛法呢基焦磷酸合酶基因片段的克隆与序列分析  79-93
  1.材料与方法  79-85
    1.1 材料与试剂  79
    1.2 仪器和试剂  79-80
    1.3 实验方法  80-85
  2.结果与分析  85-91
    2.1 RNA样品的紫外扫描分析  85-86
    2.2 石斛RNA样品的电泳检测  86
    2.3 RT-PCR扩增及其产物的克隆与测序  86-88
    2.4 氨基酸序列的同源性分析  88-90
    2.5 氨基酸序列的系统进化分析  90-91
  3.讨论  91-92
    3.1 石斛总RNA的提取  91-92
    3.2 RT-PCR扩增及其产物的克隆与分析  92
  4.小结  92-93
结论  93-95
参考文献  95-109
致谢  109-110
作者简介  110-111

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