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米根霉CICIM F0071α-淀粉酶：基因克隆、鉴定与异源表达

作　者: 李松
导　师: 王正祥；石贵阳；沈微
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 米根霉α-淀粉酶 基因克隆 异源表达 酶学性质研究 淀粉水解
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


真菌α-淀粉酶可以水解淀粉或麦芽聚糖内部的α-1,4-糖苷键,水解产物中主要为麦芽糖,主要应用于淀粉糖浆、焙烤制品、啤酒酿制等领域,是重要的工业酶制剂之一。我国真菌α-淀粉酶的研究水平不高,几乎所有研究均没有涉及基因的克隆与表达,发酵生产方式也未从固态发酵向液体发酵转变,发酵生产水平与国际先进水平也存在较大差距。酶制剂产品为多种α-淀粉酶、糖化酶和葡萄糖苷酶的混合产品,往往无法有效的进行目的产物的生成。为此,本论文以研究和开发具有特定应用价值的新型真菌α-淀粉酶为目的,对两株米根霉（CICIM F0071和CICIM F0072）的α-淀粉酶基因进行了克隆和功能鉴定;并将其中一条基因导入多种真核细胞,实现了异源表达;纯化了重组米根霉α-淀粉酶,并对其进行了酶学性质研究。获得如下主要研究结果:（1）对2个米根霉α-淀粉酶基因进行了克隆、鉴定和功能性表达。2条米根霉α-淀粉酶编码基因大小均为1386 bp,2条基因之间的差异为3.02%,推衍得到的氨基酸序列之间的差异为1.95%;与已报道的其他真菌α-淀粉酶的相似度最高为42.8%。该基因编码产物属于淀粉酶家族13成员,具有淀粉酶家族所特有的4个典型的高度保守区域。以质粒载体pET-28a （+）为基础构建相关表达载体,实现了2条淀粉酶基因在大肠杆菌中的功能性表达。RoAmy1和RoAmy2在大肠杆菌中可表达1.3 U/mL和0.5 U/mL的酶活。（2）纯化了2个重组米根霉α-淀粉酶并对其酶学性质进行了研究。通过亲和层析获得了2个重组米根霉α-淀粉酶RoAmy1和RoAmy2的纯品,SDS-PAGE显示其分子量约为48 kDa。酶学性质研究结果显示,2个淀粉酶的性质非常相近,其最适作用pH范围为4.06.0,在pH 4.56.5之间较为稳定;其最适温度均为60℃,在50℃以下较为稳定。以可溶性淀粉为底物获得RoAmy1的Km和Vmax分别0.27 mg/mL和0.068 mg/min,比酶活为1123.4 U/mg;RoAmy2的Km和Vmax分别为0.27 mg/mL和0.064 mg/min,比酶活为1118.6 U/mg。浓度为5 mmol/L的Cu2+和Fe2+对该酶有明显的抑制作用,为非Ca2+依赖型。以马铃薯淀粉为底物时,使用RoAmy1作用后的终产物中最高含74% （w/w）的麦芽糖;该酶对麦芽三糖亲和力较强（Km=0.22 mmol/L）,当麦芽三糖初始浓度为40 mmol/L时,使用RoAmy1作用后终产物中葡萄糖与麦芽糖的浓度比值约为1:4。（3）研究建立了黑曲霉表达体系,建立并优化了其遗传转化方法,构建了多种分泌型表达载体,实现了米根霉α-淀粉酶在黑曲霉中的表达。以潮霉素B为抗性筛选标记,从孢子萌发时间、电场强度及质粒浓度等方面考察了电转化效率的影响因素。研究表明,使用黑曲霉菌株MGG029-ΔaamA,最优电转化条件为:孢子龄为4 d,孢子萌发时间为2 h,电场强度为5 kV/cm。研究中以潮霉素B为抗性筛选标记,使用三磷酸甘油醛脱氢酶启动子（PgpdA）和糖化酶启动子（PglaA）构建相关表达载体pPTH-RoAmy,pPglaA-RoAmy和pPglaAs-RoAmy,利用此表达载体实现了米根霉α-淀粉酶在黑曲霉菌株MGG029-ΔaamA中的表达,最高表达水平约1415 U/mL。对重组菌胞外和胞内淀粉酶活力的检测和比较发现,该淀粉酶利用自身信号肽及黑曲霉糖化酶信号肽均可在黑曲霉中实现分泌表达,且表达量没有明显差异。将该淀粉酶在黑曲霉菌株CICIM F0521中进行表达,其淀粉酶相对分泌量约45 U/mL。（4）研究了酵母表达系统对米根霉α-淀粉酶的表达,实现了其在毕赤氏酵母表达体系中的高效表达。对米根霉α-淀粉酶在酿酒酵母和克鲁维乳酸酵母中的表达进行了初步研究。摇瓶发酵条件下获得重组酿酒酵母W303-1A的酶最高表达量为1.3 U/ml,在克鲁维乳酸酵母中表达约22.4 U/mL的酶活。利用组成型三磷酸甘油醛脱氢酶启动子（GAP）和诱导型醇氧化酶启动子（AOX1）构建相关表达载体,分别实现了米根霉α-淀粉酶在巴斯德毕赤酵母中的表达。在摇瓶发酵条件下,甲醇快速利用型转化子（Mut+）对该淀粉酶的表达量（41 U/mL）约为甲醇慢速利用型转化子（MutS）的8倍,约为组成型表达的24倍。在诱导型或组成型表达方式下,分别考察了使用酿酒酵母α-因子信号肽和米根霉α-淀粉酶自身信号肽进行该淀粉酶的表达情况。使用自身信号肽时,酶的表达量比使用α-因子信号肽时约高7%10%。以摇瓶发酵数据为基础确定15 L发酵罐放大实验条件为:无机盐培养基,温度为30℃,pH值为6.0,接种量为10% （v/v）,甲醇流加方式采用DO-Start法控制。在此发酵条件下结合使用AOX1和GAP启动子时获得的淀粉酶表达量最高,约为462.8 U/mL （0.42 mg/mL）,约为摇瓶发酵方式获得的淀粉酶表达量的9倍。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-7
缩略表  7-13
第一章 前言  13-24
  1.1 淀粉及其主要衍生物  13-14
  1.2 淀粉水解酶  14-20
    1.2.1 淀粉酶及其分类  14-15
    1.2.2 α-淀粉酶的结构及其催化机制  15-19
    1.2.3 α-淀粉酶的来源及应用  19-20
  1.3 真菌α-淀粉酶  20-23
    1.3.1 真菌α-淀粉酶的来源及性质  20-21
    1.3.2 真菌α-淀粉酶的种类  21-22
    1.3.3 真菌α-淀粉酶的应用  22
    1.3.4 真菌α-淀粉酶的异源表达  22-23
  1.4 本课题的立题依据及研究内容  23-24
第二章 米根霉α-淀粉酶基因的克隆与功能鉴定  24-36
  2.1 前言  24
  2.2 材料与方法  24-27
    2.2.1 菌株和质粒  24
    2.2.2 工具酶和试剂  24
    2.2.3 培养基和培养条件  24-25
    2.2.4 主要仪器  25
    2.2.5 寡核苷酸引物  25-26
    2.2.6 米根霉RNA 的提取  26
    2.2.7 基因克隆、序列测定与分析  26
    2.2.8 质粒DNA 制备及DNA 的酶切、纯化、连接、大肠杆菌转化等分子操作  26
    2.2.9 RoAmy 在大肠杆菌中的表达及粗酶液的制备  26-27
    2.2.10 酶活测定  27
    2.2.11 SDS-PAGE  27
  2.3 结果  27-35
    2.3.1 米根霉α-淀粉酶基因的扩增及序列测定  27-29
    2.3.2 重组大肠杆菌的构建  29-30
    2.3.3 RoAmy 的功能鉴定  30-31
    2.3.4 RoAmy 及其推衍氨基酸比对分析  31-32
    2.3.5 RoAmy 的结构分析  32-34
    2.3.6 RoAmy 的遗传进化分析  34-35
  2.4 讨论  35-36
第三章 重组米根霉α-淀粉酶的生化性质  36-48
  3.1 前言  36
  3.2 材料与方法  36-38
    3.2.1 菌株  36
    3.2.2 试剂  36
    3.2.3 培养基和培养条件  36
    3.2.4 主要仪器  36
    3.2.5 rRoAmy 的纯化  36-37
    3.2.6 rRoAmy 基本酶学性质  37-38
    3.2.7 寡糖的高压液相色谱分析  38
    3.2.8 酶活测定  38
    3.2.9 蛋白质浓度测定和SDS-PAGE  38
  3.3 结果  38-45
    3.3.1 rRoAmy 的纯化  38-39
    3.3.2 温度和pH 对rRoAmy 的影响  39-41
    3.3.3 金属离子和EDTA 对rRoAmy 的影响  41-42
    3.3.4 rRoAmy 的米氏常数测定  42
    3.3.5 rRoAmy 对不同底物的水解效率  42-43
    3.3.6 rRoAmy 作用麦芽三糖终产物分析  43
    3.3.7 rRoAmy1 与商品真菌α-淀粉酶作用淀粉终产物比较  43-45
  3.4 讨论  45-48
第四章 米根霉α-淀粉酶在酿酒酵母和克鲁维乳酸酵母中的表达  48-59
  4.1 前言  48
  4.2 材料与方法  48-50
    4.2.1 菌株和质粒  48
    4.2.2 工具酶和试剂  48
    4.2.3 培养基和培养条件  48-49
    4.2.4 主要仪器  49
    4.2.5 酵母的转化  49
    4.2.6 重组酵母的筛选  49
    4.2.7 摇瓶发酵试验  49-50
    4.2.8 酶活测定  50
    4.2.9 SDS-PAGE  50
    4.2.10 淀粉浓度的测定  50
    4.2.11 乙醇浓度的测定  50
  4.3 结果  50-57
    4.3.1 酿酒酵母表达质粒的构建及转化  50
    4.3.2 克鲁维乳酸酵母表达质粒的构建及转化  50-51
    4.3.3 具有α-淀粉酶分泌能力的重组酵母的检测与筛选  51-52
    4.3.4 RoAmy 在酿酒酵母中的分泌表达  52
    4.3.5 重组酿酒酵母利用淀粉的生长情况  52-54
    4.3.6 RoAmy 在克鲁维乳酸酵母中的分泌表达  54-56
    4.3.7 重组酵母克鲁维乳酸酵母利用淀粉的生长情况  56-57
  4.4 讨论  57-59
第五章 黑曲霉表达系统表达米根霉α-淀粉酶  59-75
  5.1 前言  59
  5.2 材料与方法  59-62
    5.2.1 菌株和质粒  59-60
    5.2.2 工具酶和试剂  60
    5.2.3 培养基和培养条件  60
    5.2.4 主要仪器  60-61
    5.2.5 寡核苷酸引物  61
    5.2.6 黑曲霉电转化方法  61-62
    5.2.7 转化子的纯化  62
    5.2.8 基因拷贝数的测定  62
    5.2.9 RoAmy 在黑曲霉中的表达  62
    5.2.10 酶活测定  62
  5.3 结果  62-72
    5.3.1 使用gpdA 启动子构建表达载体  62-63
    5.3.2 使用glaA 启动子构建表达载体  63-66
    5.3.3 电转化条件的建立  66-69
    5.3.4 重组菌株的遗传稳定性检测  69
    5.3.5 重组菌株的淀粉酶分泌能力检测  69-70
    5.3.6 RoAmy 基因拷贝数的测定  70
    5.3.7 淀粉酶利用不同启动子进行表达  70-71
    5.3.8 不同信号肽引导淀粉酶的分泌表达比较  71
    5.3.9 添加潮霉素B 对重组菌产淀粉酶的影响  71-72
  5.4 讨论  72-75
第六章 米根霉α-淀粉酶在巴斯德毕赤酵母中的高效表达  75-90
  6.1 前言  75
  6.2 材料与方法  75-78
    6.2.1 菌株和质粒  75-76
    6.2.2 工具酶和试剂  76
    6.2.3 培养基和培养条件  76
    6.2.4 主要仪器  76
    6.2.5 寡核苷酸引物  76
    6.2.6 毕赤酵母的转化  76
    6.2.7 重组毕赤酵母的二次转化  76-77
    6.2.8 转化子的筛选  77
    6.2.9 基因拷贝数的测定  77
    6.2.10 RoAmy 在毕赤酵母中的分泌表达  77-78
    6.2.11 重组酵母胞内酶活的检测  78
    6.2.12 酶活测定  78
    6.2.13 SDS-PAGE 和Native-PAGE  78
  6.3 结果  78-88
    6.3.1 诱导型表达质粒的构建  78
    6.3.2 组成型表达质粒的构建  78-80
    6.3.3 重组酵母的筛选与鉴定  80-81
    6.3.4 RoAmy 基因拷贝数的测定  81
    6.3.5 利用甲醇快速利用型重组酵母实现RoAmy 的过量表达  81-82
    6.3.6 组成型表达的研究  82
    6.3.7 利用混合型表达进一步提高RoAmy 的异源表达量  82-83
    6.3.8 利用自身信号肽实现RoAmy 在毕赤酵母中表达  83-84
    6.3.9 15 L 发酵罐放大试验  84-88
  6.4 讨论  88-90
主要结论  90-92
论文创新点  92-93
致谢  93-94
参考文献  94-106
附录：读博期间发表的论文 (含待发表)  106

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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