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胶质瘤中β-catenin/STAT3转录调控miR-21及其促进胶质瘤侵袭的研究

作　者: 岳晓
导　师: 康春生
学　校: 天津医科大学
专　业: 外科学
关键词: 胶质瘤转录调控 Wnt/β-catenin通路 STAT3 miR-21 RECK 侵袭
分类号: R739.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤,约占颅内肿瘤的46%。按照世界卫生组织脑瘤病理分类,根据恶性程度共分四级,其中Ⅲ级间变性胶质瘤与Ⅳ级胶质母细胞瘤均为恶性胶质瘤,预后很差,死亡率高。胶质瘤呈浸润性生长,手术很难完全切除；化疗和放疗不能高度特异性地杀伤胶质瘤细胞,治疗效果差,还可能产生中枢神经系统的毒、副作用。所以即或采用综合治疗后,其预后仍很差。Ⅲ级间变性胶质瘤的中位生存期为1.5年,而Ⅳ级胶质母细胞瘤的中位生存期仅为9-12个月。胶质瘤是一种多基因异常疾病,胶质瘤发生发展主要是原癌基因的激活与抑癌基因的失活并由此产生一系列基因异常和动态演进的结果。恶性胶质瘤是一种多基因异常疾病,各种原癌基因的过表达及抑癌基因的突变、缺失等造成多种信号通路的异常激活,其中被广泛研究并与胶质瘤发生发展及预后密切相关的是Wnt/β-catenin信号通路。经典Wnt/β-catenin通路是肿瘤生成过程中重要的通路之一。已明确Wnt/β-catenin通路参与肿瘤发生，细胞周期调控、发育与分化、血管生成、凋亡与死亡和细胞代谢等等多种机制异常的病理过程,且与多个通路有着广泛而密切的联系。β-catenin/TCF-4复合物能转录调控一系列原癌基因的表达,如EGFR、CyclinD, c-myc和AXIN等,这些下游转录物在肿瘤的生物学行为调控中起重要作用。其中Wnt/β-catenin通路下游重要因子STAT3在肿瘤的发生发展及病人转归预后方面也发挥着极其重要的作用。STAT3在最开始被发现时,仅仅是被看作是STAT家族中一个简单的附加成员,在炎症反应时IL-6的释放反应中,发挥作用诱导一套有限的靶基因转录。但是目前已知的研究结果表明,STAT3可以被许多细胞因子、生长因子和其它刺激所激活,比其它STAT蛋白有着更为重要的生理功能。例如STAT3基因缺陷的胚胎在发育的早期(约7.5天左右)就会死亡,提示它在早期发育过程中有着重要作用。当然这一过程的自然情况、它的生理激活因子、甚至在胚胎或胚胎外组织中内激活位点都还没有确定,而且前已知的STAT3激活因子都不具备这种胚胎期的功能。大量文章表明肿瘤细胞中,STAT3的活性可以促进细胞因子诱导的肿瘤生长,为了研究肿瘤细胞STAT3在炎症相关的肿瘤发生过程中的作用,Bollrath和Grivennikov等人培养出一种Stat3 IEC小鼠、该小鼠的肠上皮细胞(intestinal epithelial cell,IEC)特异性地缺失STAT3的表达。在葡聚糖硫酸钠(dextran Sodium Sulphate,DSS)诱导的肠炎相关的癌症(colitis-associated cancer,CAC)模型中,Stat3IEC小鼠比充分表达STAT3的小鼠发生肿瘤的数量和肿瘤体积都要小。他们两个的团队都发现STAT3的活性可以上调抗凋亡蛋白的表达,而且促进癌前病变IEC细胞的生存和增殖相关细胞周期基因的表达也受STAT3活性诱导。目前研究发现miRNA表达与多种癌症相关,其在肿瘤发生发展过程中起着至关重要的作用,肿瘤中表达水平异常的miRNA可能发挥类似癌基因或抑癌基因的作用。虽然miR-21在胶质瘤中的研究仍处于起步阶段,但大量文献报道其在恶性胶质瘤中呈高表达状态并发挥着类似癌基因的作用,它参与多种信号通路的活化与抑制,并影响肿瘤包括增殖、凋亡和转移在内的各种生物学行为。除此以外miR-21还在肺癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌等多种肿瘤中的表达也异常增高。这些研究结果都表明miR-21可能以一种原癌基因的身份影响着各种肿瘤的表型及预后。本室前期已经证明反义miR-21可通过抑制EGFR降低P13K-AKT信号通路的活性并且证实在PTEN突变的U251细胞以及含野生型PTEN的LN229细胞中具有相同的作用,说明miR-21可以不通过PTEN而影响EGFR表达在对胶质瘤中miRNA表达谱的研究中发现miR-21与胶质瘤的生存及预后密切相关。目前,对于肿瘤中信号通路与miRNAs之间的调控关系在国内外尚未见详细报道。本课题通过大量的体内外实验证实了Wnt信号通路通过介导STAT3表达转录调控miR-21从而影响胶质瘤细胞的恶性表型。共分以下三部分：第一部分：应用Real Time实时荧光定量PCR的检测方法对90例脑胶质瘤各级别的手术标本进行miR-21的定量检测,结果发现miR-21在脑胶质瘤中异常高表达,并与胶质瘤分级呈明显正相关。第二部分：应用western blot、PCR、免疫组化及荧光素酶等多种实验证明Wntβ-catenin信号通路通过STAT3介导miR-21表达。第三部分：应用各种体内外文实验证明下调miR-21表达后,RECK表达升高,阐明了反义miR-21抑制胶质瘤细胞的侵袭性生长的作用机制。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
符号说明  10-11
前言  11-14
  研究现状、成果  11-13
  研究目的、方法  13-14
miR-21在胶质瘤病人中异常高表达并与分级成正相关  14-26
  1.1 前言  14-16
  1.2 材料与方法  16-20
    1.2.1 实时荧光定量PCR检测miR-21表达  16-18
    1.2.2 原位杂交法检测miR-21过表达  18-20
  1.3 结果  20-23
    1.3.1 总RNA的提取与质控  20
    1.3.2 miR-21 RT-Real time PCR验证miR-21在人脑胶质瘤中的高表达并与分级成正相关  20-22
    1.3.3 原位杂交证实miR-21阳性率和表达阳性程度与胶质瘤级别正相关  22-23
  1.4 讨论  23-25
  小结  25-26
Wnt/β-catenin信号通路通过STAT3介导miR-21表达  26-55
  2.1 前言  26-28
  2.2 材料与方法  28-36
    2.2.1 实验材料  28-29
    2.2.2 实验方法  29-36
  2.3 结果  36-53
    2.3.1 β-catenin调控miR-21的表达  36-38
    2.3.2 STAT3介导β-catenin调控miR-21  38-53
  2.4 讨论  53-54
  2.5 小结  54-55
反义miR-21通过RECK抑制胶质瘤细胞的侵袭  55-77
  3.1 前言  55-56
  3.2 材料与方法  56-64
    3.2.1 实验材料  56-57
    3.2.2 实验方法  57-64
  3.3 结果  64-75
    3.3.1 Real-time PCR检测转染AS-miR-21后miR-21表达  64-65
    3.3.2 RECK是miR-21下游直接靶点  65-68
    3.3.3 转染反义miR-21后对肿瘤侵袭能力的评价  68-71
    3.3.4 动物实验及免疫荧光  71-75
  3.4 讨论  75-76
  3.5 小结  76-77
结论  77-78
参考文献  78-84
发表论文和参加科研情况说明  84-87
综述脑胶质瘤中重要信号通路的分子机制  87-100
  参考文献  96-100
致谢  100

胶质瘤中β-catenin/STAT3转录调控miR-21及其促进胶质瘤侵袭的研究

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