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人乳头瘤病毒分型及整合素抗体抑制尖锐湿疣复发的初步研究

作　者: 柯吴坚
导　师: 车雅敏
学　校: 天津医科大学
专　业: 皮肤病与性病学
关键词: 尖锐湿疣复发人乳头瘤病毒聚合酶链反应限制性片段长度多态性整合素α6 单克隆抗体永生化人角质形成细胞株
分类号: R759
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

尖锐湿疣(condyloma acuminatum, CA)是由人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)引起的,以发生在生殖器、肛周为主的性传播疾病(sexually transmitted disease, STD)。CA不仅发病率高,而且治疗后其复发率也很高。目前有多种针对CA的治疗方法,但任何一种方法都不能避免其复发。不同型的HPV感染可以引起不同的临床表现,对HPV进行分型将有利于临床疾病的诊断及预后的判定。整合素(integrin)是细胞黏附分子家族中重要的成员之一。通过大量对整合素与病毒感染关系的研究发现,多种病毒都能利用整合素作为病毒受体或共受体(co-receptor)进入宿主细胞。整合素α6主要在正常上皮组织基底层特异性表达,而HPV对宿主造成的损害,首先是以感染宿主上皮组织基底层为起始的,二者是否存在相关性?整合素α6在HPV感染过程中是否发挥作用?如果能在这个起始阶段将整合素的表达进行封闭,是否可使病毒对宿主细胞的黏附受到抑制?对这些问题的进一步研究将有助于从根本上阻断HPV病毒的感染和CA的复发。目的①鉴定和评估PCR联合限制性片段长度多态性(RFLP)及基因测序技术对CA及四种外生殖器和肛周皮肤病进行HPV DNA检测和分型的可行性；②检测CA患者皮损处整合素α6 mRNA的表达,初步探讨其在CA的发病与复发中的意义；③探讨整合素α6单克隆抗体(GoH3)对HPV 6/11病毒颗粒体外感染永生化人角质形成细胞株(HaCaT细胞)的影响。方法①应用PCR-RFLP-基因测序技术对发生于外生殖器和肛周部位的CA、鲍温样丘疹病(BP)、鳞状细胞癌(SCC)、硬化萎缩性苔藓(LSA)和乳房外Paget病(EMPD)的皮损组织进行HPV DNA检测和分型；②采用RT-PCR方法测定初发和复发CA患者皮损处整合素α6 mRNA的表达；③应用荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法检测GoH3对临床CA组织中提取的HPV 6/病毒颗粒感染HaCaT细胞后HPV DNA载量的影响。结果①50例经病理确诊的CA及四种外生殖器和肛周皮肤病标本中,共有35例检测出HPV DNA,其阳性率分别为CA 100.0%(26/26)、BP 47.1%(8/17)、SCC 50.0%(1/2)、LSA 0.0%(0/4)和EMPD 0.0%(0/1); HPV DNA阳性标本中,HPV 6型19例,HPV-11型3例,HPV 16型8例,HPV 6型+11型4例,HPV 62型1例；基因测序结果与PCR-RFLP判定的HPV型别相符；②整合素α6在初发和复发CA皮损中.nRNA的相对病毒载量分别0.79±0.16和1.07±0.29,均高于正常包皮组织的0.25+0.10,差异有统计学意义(P=0.001)；复发CA皮损中整合素α6的表达高于初发,差异有统计学意义(P<0.05)；③4组不同浓度的HPV 6/11病毒颗粒感染HaCaT细胞后测得的HPV病毒载量不同(P=0.001)。当病毒颗粒浓度为106copies/ml时,HaCaT细胞被感染率为100%,且所测得的HPV载量高于其它3组(P<0.05)；当GoH3稀释倍数>1：100时,其对HPV感染HaCaT细胞的抑制率与其浓度成正比；但当稀释倍数<1：100时,再增加GoH3的浓度,其抑制率也未见明显增长；8例临床分离的HPV 6/11病毒颗粒在加入GoH3之前感染HaCaT细胞的平均病毒载量为(5.8±2.51)×104copies/ml,加入GoH3后感染HaCaT细胞的平均病毒载量为(3.02±1.21)×104copies/ml, GoH3的平均抑制率为(46.9±4.7)%。结论①PCR-RFLP方法可用于HPV DNA检测与分型；②整合素α6可能在CA发病和复发中发挥作用；③GoH3对HPV 6/11型感染HaCaT细胞具有一定的抑制作用。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-10
缩略语/符号说明  10-13
前言  13-18
  研究现状、成果  13-16
  研究目的、方法  16-18
一、PCR联合RFLP及基因测序技术对尖锐湿疣及四种外生殖器和肛周皮肤病进行HPV DNA检测与分型  18-36
  1.1 资料和方法  18-25
    1.1.1 资料  18-20
    1.1.2 方法  20-25
  1.2 结果  25-32
    1.2.1 尖锐湿疣及四种外生殖器和肛周皮肤病的临床及病理照片  25-26
    1.2.2 PCR方法对HPV DNA扩增结果  26-27
    1.2.3 PCR-RFLP对HPV进行分型结果  27
    1.2.4 HPV各型别酶切后PAGE图  27-29
    1.2.5 HPV基因序列分析结果  29-31
    1.2.6 50例临床标本HPV DNA分型结果  31-32
  1.3 讨论  32-35
  1.4 小结  35-36
二、整合素α6 mRNA在尖锐湿疣患者皮损中的表达  36-45
  2.1 资料和方法  36-41
    2.1.1 资料  36-37
    2.1.2 方法  37-40
    2.1.3 统计分析  40-41
  2.2 结果  41-42
    2.2.1 组织中总RNA的提取结果  41
    2.2.2 整合素α6 mRNA检测结果  41-42
    2.2.3 初发CA与复发CA皮损整合素α6 mRNA的表达结果  42
  2.3 讨论  42-44
  2.4 小结  44-45
三、整合素α6单克隆抗体对HPV 6/11病毒颗粒体外感染HaCaT细胞的影响  45-58
  3.1 资料和方法  45-52
    3.1.1 资料  45-47
    3.1.2 方法  47-52
    3.1.3 统计分析  52
  3.2 结果  52-55
    3.2.1 感染HPV 6/11病毒颗粒前后HaCaT细胞形态变化  52
    3.2.2 临床CA组织FQ-PCR检测结果  52-53
    3.2.3 不同浓度HPV 6/11病毒颗粒体外感染HaCaT细胞后HPV DNA载量的检测结果  53
    3.2.4 加入不同浓度GoH3后,HPV 6/11病毒颗粒体外感染HaCaT细胞后HPVDNA载量的检测结果  53-55
    3.2.5 加入GoH3前后,8例临床分离的HPV 6/11病毒颗粒体外感染HaCaT细胞后HPV DNA载量的变化  55
  3.3 讨论  55-56
  3.4 小结  56-58
结论  58-59
参考文献  59-64
发表论文和参加科研情况说明  64-66
综述尖锐湿疣复发的相关因素及防治策略  66-73
  综述参考文献  70-73
致谢  73

人乳头瘤病毒分型及整合素抗体抑制尖锐湿疣复发的初步研究

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