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Shh基因转染骨髓间充质干细胞治疗急性缺血性心脏病的实验研究

作　者: 史进
导　师: 杨进福
学　校: 中南大学
专　业: 外科学
关键词: 骨髓间充质干细胞表达核转染转染急性缺血性心脏病急性心肌梗死模型细胞移植
分类号: R542.22
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

急性心肌梗死是指心肌急性缺血、缺氧所引起的心肌坏死,是人类心衰和猝死的重要原因之一。随着我国人民生活水平的提高,其在我国的发病率也不断升高。在急性心肌梗死后,由于心肌细胞严重丧失,直接导致心脏舒缩功能下降、血流动力学改变、心室重构及其他器官的继发性病变。在急性心肌梗死后,梗死区内部及周边的心肌细胞及干细胞的修复作用有限,所以这种修复不足以中止或逆转心梗患者病情的发展。目前在终末期心衰的治疗上,心脏移植在技术上已经比较成熟,但鉴于供体来源少、免疫抑制治疗时间长以及治疗费用高昂等原因,使心脏移植不可能成为常规的治疗方案。在此背景下细胞治疗和基因治疗急性缺血性心脏病逐渐成为临床研究的热点。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell, BMMSC)属于骨髓基质干细胞,是骨髓中的具有自我更新能力的多潜能细胞,在一定条件下,能分化成多种功能细胞。具有容易获取,易于培养扩增,低免疫原性,多次传代后生物学特性稳定,无伦理道德问题等优势,在细胞治疗领域有广阔的临床应用前景。同时,BMMSC可作为载体细胞,接受多种基因转染并在体内分化后仍能保持较良好的生物学特性,使转染基因能稳定而持续的表达,以达到治疗的目的；而外源性基因在BMMSC中的表达也有利于增强其移植效应及提高其分化率。由此,我们假设能将Shh基因转入BMMSC中,在确定表达稳定后,再把携带外源性Shh基因的BMMSC移植到急性心肌梗死区,这样基因治疗和细胞治疗就有可能起到二者相互协同、相互促进的作用,其效果可能优于单用。本实验分为两个部分：第一部分(Shh基因转染BMMSC),以淋巴细胞分离液法获取Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,利用Amaxa的Nucleofector核转染仪将Shh外源性基因转染入大鼠BMMSC,并检测基因表达情况；第二部分(Shh基因转染的BMMSC移植对大鼠心功能的影响),结扎大鼠左冠状动脉前降支制作大鼠急性心肌梗死模型,于模型制作成功后在梗死区直接注射移植携带Shh基因的BMMSC,然后在注射移植后第1、2、4、8周分别检测心功能等指标,以此来判断其治疗效果。第一部分：Shh基因转染BMMSC目的：探讨Shh基因转染BMMSC可行性方法：1.采用淋巴细胞分离液法获取Wistar大鼠的BMMSC。绘制其生长曲线,检测BMMSC表面标志物CD34、D44、CD45和SH3。2.利用Amaxa的Nucleofector核转染仪转染pcDNA3.1 (-)-Shh进入BMMSC,观察转染后BMMSC的形态和生长状况的变化,鉴定Shh基因的表达情况。结果：1.采用淋巴细胞分离液法可以成功分离大鼠BMMSC,以此为基础可以建立稳定的BMMSC培养体系。2.Western blot检测证实利用Amaxa的Nucleofector核转染仪能有效的将Shh基因转染至大鼠BMMSC中,并获得稳定的表达。结论：外源性Shh基因通过Nucleofector核转染仪转染BMMSC后可以稳定表达,为后续研究Shh基因转染BMMSC移植对大鼠急性心肌梗死后心脏功能的影响等提供了基础。第二部分：Shh基因转染骨髓间充质干细胞移植对大鼠心功能影响目的：探讨大鼠急性心肌梗死模型的制作,Shh基因转染BMMSC后的注射移植方法以及移植后心功能等指标的变化,并比较与基因治疗和/或细胞治疗的疗效差别。方法：以冠脉结扎法制作近交系Wistar大鼠急性心肌梗死模型,200只急性心肌缺血模型动物随机分为5组(每组40只)。转基因组(Transfection group, T)在急性心梗模型建立后立即在心肌梗死区移植转染Shh基因的BMMSC,细胞组(BMMSC group, B)在心肌梗死区移植等量的BMMSC,基因组(Gene group, G)在心肌梗死区注射pcDNA3.1-Shh DNA,混合组(Mixed group, M)在心肌梗死区注射等量BMMSC和pcDNA3.1-Shh DNA的混合物,对照组(Control group, C)在心肌梗死区注射等容积的低糖DMEM液。分别于移植后第1、2、4、8周以Buxco XA(Biosystem XA)系统检测大鼠在体心功能,并行免疫组化、电镜检测确定移植细胞的存活及分化。结果：结扎大鼠左冠状动脉前降支制作的急性心梗模型,制作成功率约为80%。移植治疗1,2周后,Buxco检测心功能显转基因组LVSP、+dp/dt有高于对照组的趋势,但尚不足以提示有显著差异。移植治疗4周后,转基因组Buxco检测心功能显示LVSP高于对照组的对应值(P=0.030),-dp/dt低于对照组的对应值(P=0.028)。移植治疗8周后,Buxco检测心功能显示转基因组LVSP高于对照组的对应值(P=0.038)。电镜及免疫组化结果显示,移植区干细胞存活并可以向心肌细胞方向转化。结论：Shh转染BMMSC移植可用于治疗急性缺血性心脏病,其综合疗效与基因治疗和/或细胞治疗的比较尚需进一步实验。

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中文摘要  5-10
ABSTRACT  10-16
前言  16-19
第一部分:SHH基因转染骨髓间充质干细胞  19-28
  研究背景  19
  材料与方法  19-22
  结果  22-24
  讨论  24-27
  结论  27-28
第二部分:SHH基因转染骨髓间充质干细胞移植对大鼠心功能的影响  28-42
  研究背景  28-29
  材料与方法  29-34
  结果  34-39
  讨论  39-41
  结论  41-42
参考文献  42-45
综述  45-56
  参考文献  51-56
致谢  56

Shh基因转染骨髓间充质干细胞治疗急性缺血性心脏病的实验研究

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