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重组花生过敏原Ara h2壳聚糖纳米粒的制备及其抗过敏作用

作　者: 魏波
导　师: 陈红兵
学　校: 南昌大学
专　业: 食品科学
关键词: 花生过敏花生过敏原Ara h 2 壳聚糖纳米粒抗花生过敏
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

花生过敏是一个引起人们高度关注的食品安全问题,花生过敏多见于速发型过敏反应,有较高的患病率,并且危害患者的生命。迄今为止,国外学者在花生过敏的治疗方面做了许多相关的研究,却没有发现很好的治疗手段,最佳的方法就是避免摄入花生相关的食品。本研究根据壳聚糖具有组织相容性好、毒副作用小,对人体无危害等优良性质,结合壳聚糖纳米粒的缓释以及不易被消化等特性,制备重组Ara h2壳聚糖纳米粒,研究该纳米粒在花生过敏小鼠中的作用。本论文工作包括花生过敏原Ara h 2的原核表达及纯化、重组Ara h 2壳聚糖纳米粒的的制备、花生过敏小鼠模型的构建及重组Ara h 2壳聚糖纳米粒抗过敏作用的实验动物学研究。主要研究工作结果及结论如下。1人工合成Ara h 2基因,利用基因工程技术成功地构建了pET-32a-Ara h 2表达载体,并将其转入E.coli origami宿主菌中,酶切分析显示构建正确。经DNA测序分析表明插入片段位置、方向、大小序列均正确。用IPTG进行诱导,通过不连续SDS-PAGE电泳分析,获得了分子量约为35kD的表达蛋白,与理论值相符。菌体经过超声粉碎,分离超声后的上清和沉淀,分别进行SDS-PAGE电泳检测,结果表明表达蛋白为部分可溶性。用Ni2+亲和层析柱纯化含有His标签的重组Arah2蛋白,纯化得到了重组Ara h 2蛋白。2采用离子交联法制备重组Ara h 2壳聚糖纳米粒,重组Ara h 2被壳聚糖包裹后,通过BCA法检测蛋白浓度并计算重组Ara h 2壳聚糖纳米粒的包封率和载药率。SDS-PAGE电泳检测表明,Ara h 2被成功地包裹在壳聚糖中,扫描电镜(SEM)鉴定该纳米粒粒径为230nm-670nm,进一步用花生过敏病人血清作为一抗进行Western-Blotting分析,结果发现重组Ara h 2壳聚糖纳米粒能与血清特异性IgE结合,表明已成功制备了具有免疫原活性的重组Ara h 2壳聚糖纳米粒。3将用丙酮脱脂法提取的花生粗蛋白通过皮下注射C57BL/C小鼠致敏,同时设立阴性对照(Naive)组,然后再用重组Ara h 2壳聚糖纳米粒经灌胃给药治疗致敏小鼠,并分别设立重组Ara h 2和壳聚糖纳米粒对照组。处死小鼠,用ELISA法检测血清特异性IgE、IgG2a、血浆组胺水平及脾细胞分泌IL-4、IL5、IL13、IFN-r的水平。与其它组相比,经过重组Ara h 2壳聚糖纳米粒治疗后,明显降低血清特异性IgE及血浆组胺水平,上调特异性IgG2a水平,同时使脾细胞分泌IL-4、IL-5、IL-13的水平下降,而IFN-r的分泌量增加。研究结果表明,以壳聚糖为佐剂的重组Ara h 2纳米粒进行免疫治疗,能够逆转Th1/Th2反应平衡,产生以Th1为主的免疫应答。因此,重组Ara h 2壳聚糖纳米粒具有抗花生过敏的显著功效。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-13
第1章综述  13-23
  1.1 前言  13
  1.2 花生过敏  13-16
    1.2.1 花生过敏的危害  13-14
    1.2.2 花生主要过敏原及其研究进展  14-16
      1.2.2.1 Ara h 1  14-15
      1.2.2.2 Ara h 2  15
      1.2.2.3 Ara h 3  15-16
  1.3 食物过敏的防治  16-19
    1.3.1 经典特异性免疫治疗  16
    1.3.2 肽免疫疗法  16-17
    1.3.3 突变过敏原蛋白免疫疗法  17-18
    1.3.4 非特异性的免疫治疗  18
    1.3.5 DNA免疫疗法  18-19
    1.3.6 自然疗法  19
  1.4 花生过敏的预防及其治疗研究进展  19-20
  1.5 壳聚糖纳米粒疫苗  20-23
    1.5.1 纳米物质  20
    1.5.2 壳聚糖  20-21
    1.5.3 制备壳聚糖纳米粒  21-22
    1.5.4 壳聚糖纳米粒疫苗  22-23
第2章重组花生Ara h 2蛋白的制备  23-43
  2.1 引言  23
  2.2 材料  23-26
    2.2.1 菌株、质粒  23
    2.2.2 工具酶、分子量Marker及主要试剂  23-24
    2.2.3 主要仪器与设备  24
    2.2.4 常规培养基及溶液配制  24-26
  2.3 实验方法与步骤  26-35
    2.3.1 Ara h 2重组质粒提取  26
    2.3.2 用EcoRI和HindⅢ双酶切Ara h 2重组质粒及pET-32a载体  26-27
      2.3.2.1 Ara h 2重组质粒双酶切  26-27
      2.3.2.2 pET-32a载体双酶切  27
    2.3.3 回收双酶切后的DNA片段  27-28
    2.3.4 构建pET-32a-Ara h 2重组质粒  28
    2.3.5 大肠杆菌E.coli Top10感受态细胞的制备  28-29
    2.3.6 连接产物转化感受态细胞  29
    2.3.7 pET-32a-Ara h 2重组质粒的鉴定  29-30
      2.3.7.1 pET-32a-Ara h 2重组质粒的提取  29-30
      2.3.7.2 双酶切鉴定  30
      2.3.7.3 DNA测序  30
    2.3.8 目的基因的原核表达及SDS-PAGE检测  30-33
      2.3.8.1 大肠杆菌E.coli origami感受态细胞的制备  30-31
      2.3.8.2 pET-32a-Ara h 2质粒转化感受态  31
      2.3.8.3 目的基因的原核表达  31-32
      2.3.8.4 重组蛋白的SDS-PAGE检测  32-33
    2.3.9 分离纯化重组蛋白  33-35
      2.3.9.1 超声破碎菌体  33-34
      2.3.9.2 亲和纯化重组蛋白  34
      2.3.9.3 透析重组蛋白  34-35
      2.3.9.4 纯化后重组蛋白的SDS-PAGE电泳检测  35
      2.3.9.5 重组蛋白浓度测定  35
  2.4 结果与分析  35-41
    2.4.1 pET-32a-Ara h 2重组质粒的构建  36
    2.4.2 pET-32a-Ara h 2重组质粒的鉴定  36-37
      2.4.2.1 连接产物转化感受态细胞  36-37
      2.4.2.2 质粒提取与限制性内切酶酶切鉴定  37
    2.4.3 pET-32a-Ara h 2重组质粒转化E.coli origami感受态细胞  37-38
    2.4.4 重组蛋白诱导表达的SDS-PAGE检测分析  38-39
    2.4.5 细胞破碎与亲和纯化的SDS-PAGE检测  39-40
    2.4.6 重组Ara h 2的浓度  40-41
  2.5 讨论  41-42
  2.6 小结  42-43
第3章重组Ara h 2壳聚糖纳米粒的制备  43-51
  3.1 引言  43
  3.2 材料与试剂  43
  3.3 主要仪器  43-44
  3.4 实验方法与步骤  44-46
    3.4.1 离子交联法制备重组Ara h 2壳聚糖纳米粒(CS-R-Ara h 2)  44
    3.4.2 CS-R-Ara h 2包封率和载药量测定  44
    3.4.3 CS-R-Ara h 2纳米粒SDS-PAGE电泳检测  44-45
    3.4.4 CS-R-Ara h 2纳米粒外貌形态的SEM电镜检测  45
    3.4.5 CS-R-Ara h 2纳米的Western-Blotting鉴定  45-46
  3.5 结果与分析  46-49
    3.5.1 CS-R-Ara h 2纳米粒的包封率(AE)和载药量(LC)  46-47
    3.5.2 CS-R-Ara h 2纳米粒的SDS-PAGE电泳鉴定  47
    3.5.3 CS-R-Ara h 2纳米粒的SEM电镜检测结果  47-48
    3.5.4 CS-R-Ara h 2纳米粒的Western-Blotting鉴定  48-49
  3.6 讨论  49-50
  3.7 小结  50-51
第4章重组过敏原Ara h 2壳聚糖纳米粒抗过敏反应的实验动物学研究  51-67
  4.1 引言  51
  4.2 材料与试剂  51-52
  4.3 主要仪器设备  52
  4.4 实验方法与步骤  52-57
    4.4.1 花生粗蛋白的提取  52
    4.4.2 CPE的SDS-PAGE电泳分析  52-53
    4.4.3 CPE溶液的蛋白浓度的测定  53
    4.4.4 免疫小鼠  53-54
    4.4.5 过敏反应各项指标的检测  54-57
      4.4.5.1 血管通透性的检测  54
      4.4.5.2 小鼠血清特异性IgE的Western-Blotting分析  54-55
      4.4.5.3 血浆中组胺的检测  55
      4.4.5.4 血清中特异性IgE(sIgE)和特异性IgG2a(sIgG2a)的检测  55-56
      4.4.5.5 细胞因子的检测  56-57
  4.5 数据分析  57
  4.6 结果与分析  57-64
    4.6.1 CPE的SDS-PAGE电泳分析  57
    4.6.2 CPE的浓度测定  57-58
    4.6.3 血管通透性的检测结果  58
    4.6.4 小鼠血清特异性IgE的Western-Blotting分析  58-59
    4.6.5 血浆中组胺含量(ELISA法)  59-60
    4.6.6 血清中特异性IgE(sIgE)和特异性IgG2a(sIgG2a)的检测  60-61
    4.6.7 ELISA法检测Th1和Th2细胞因子水平  61-64
  4.7 讨论  64-66
  4.8 小结  66-67
第5章结论与展望  67-69
  5.1 结论  67
  5.2 研究展望  67-69
致谢  69-70
参考文献  70-78
攻读学位期间的研究成果  78

重组花生过敏原Ara h2壳聚糖纳米粒的制备及其抗过敏作用

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