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雌二醇鼻腔给药脑靶向制剂的研究

作　者: 王晓梅
导　师: 唐星
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 药剂学
关键词: 雌二醇 鼻用壳聚糖纳米粒 离子凝胶化法 鼻用亚微乳剂 高压均质法 在体鼻腔循环灌流法 药物动力学 微渗析 脑靶向指数 脑部药物直接转运百分比
分类号: R94
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


随着世界各国人口老龄化问题日益突出,阿尔茨海默病（AD）的发病率有随年龄增高而成倍增长的趋势。因此,预防和治疗AD的药物研发成为了人们关注的焦点。近年来的调查研究发现,AD的发病与雌激素有关。目前,以17-β雌二醇（E2）为主的雌激素替代疗法（ERT）已应用于临床,最常用的方法是口服、经皮及阴道补充疗法。然而,三种方法都有一些局限性。本研究旨在探索一条雌二醇合适的给药途径及合理的剂型,使到达脑部靶点的药物浓度增加,减少给药剂量,从而减少E2的全身吸收,降低不良反应。鼻腔给药途径是近年来研究较多的给药系统之一。其吸收迅速、无首过效应、给药方便、患者顺应性强。此外,还可用作脑内靶向递药的途径。鼻腔给药的上述特点有利于雌二醇的临床应用。E2在不同pH条件下的溶解度及表观油水分配系数的测定结果表明,E2在水中难溶,且受pH影响较小;不论在水溶液还是油中,卵磷脂对雌二醇均有一定的增溶作用;logP平均值为3.14。采用离子凝胶化法制备E2壳聚糖纳米粒。E2是一种小分子脂溶性药物,要将其制成壳聚糖纳米粒,达到指定的药物浓度,必须增加其水溶性,首先用随机甲基化β-环糊精（Randomly methylatedβ-cyclodextrin,RAMEB）制备包合物,进一步利用壳聚糖和三聚磷酸钠的交联反应制备纳米粒,以粒径及ξ-电位等为指标,考察了壳聚糖（CS）和三聚磷酸钠（TPP）溶液的浓度、CS和TPP的质量比、滴加速度、搅拌速度、温度以及药物的加入等因素,确定了E2最终处方及制备工艺:将壳聚糖溶于1%的醋酸溶液中,配制成2.0 mg·mL-1的浓度。精密移取5.0 mL,加入计算量的雌二醇包合物(使最终E2达到2.0 mg·mL-1),在磁力搅拌（1500 rpm）下,以2.0 mL·h-1的滴定速度,用注射器缓慢加入2.0 mL三聚磷酸钠溶液(1.0 mg·mL-1),搅拌30 min,调节pH至5.0,得到粒径为270 nm左右,ξ-电位为+25 mV,呈现淡蓝色乳光的壳聚糖纳米粒,药物在壳聚糖纳米粒混悬液中的包封率为65%左右,平均载药量在1.92 mg·mL-1以上。采用两级高压均质法制备雌二醇亚微乳剂,以各种稳定性参数（外观、平均粒径及粒度分布、ζ—电位、稳定性参数Ke、包封率等）为指标,对亚微乳剂制备过程中处方因素及主要工艺因素进行了研究,确定油相的组成,优化了处方中乳化剂卵磷脂与F68的比例、油酸的用量,研究了初乳制备温度、搅拌强度及搅拌时间,高压均质压力及次数等工艺因素对亚微乳剂稳定性的影响,考察了pH值对于制剂物理化学稳定性的影响,确定了最佳pH值以及适宜的灭菌条件,并由以上考察结果确定了E2亚微乳剂最终处方及制备工艺:将2.5%甘油、0.5%F68分散于适量蒸馏水中,至磁力搅拌器中加热至70℃搅拌至全部溶解;0.2%E2、2.0%卵磷脂、0.06%油酸加入至20%油中（LCT:MCT 1∶1）,加热至80℃搅拌至卵磷脂完全溶解;将油相加入至水相中,置于高速组织捣碎机中1,4000 rmp搅拌15 min,以0.1 mol·L-1氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至5.5,蒸馏水稀释定容至处方量,转移至高压均质机中,40℃下,以90MPa压力均质8次。灌装,充氮气密封,100℃旋转水浴灭菌30 min。理化性质测定显示E2亚微乳剂的平均粒径220 nm左右,ζ电位-29.0 mV,载药量为1.89 mg·mL-1,包封率为可达85%以上。应用大鼠在体鼻腔循环灌流法,考察了不同浓度E2鼻用壳聚糖纳米粒和亚微乳剂中药物的鼻粘膜吸收情况。结果表明,鼻粘膜吸收较好,并且随着浓度的增大,吸收速度常数有上升的趋势;E2亚微乳剂的吸收比壳聚糖纳米粒要好。建立了HPLC荧光法用于鼻用壳聚糖纳米粒和亚微乳剂在大鼠血及脑脊液中药物浓度的测定,方法简单准确。考察了E2鼻用壳聚糖纳米粒和亚微乳剂一个剂量组的鼻腔及静脉注射给药后在大鼠体内的药物动力学过程,并与E2包合物溶液进行了比较。测定不同时间的血药浓度,以统计矩法计算体内药动学参数。结果表明,大鼠分别静注E2包合物、E2壳聚糖纳米粒和E2亚微乳剂三种制剂后,血药浓度最高值分别（170.08±64.67）、（151.4±28.2）和（123.36±24.51）ng·mL-1,AUC0-∞值分别为（7844.60±2783.13）、（9183.88±2631.10）和（11544.94±4003.41）ng·min·mL-1,鼻腔给药后,三种制剂血中药-时曲线均呈现一个吸收过程,分别于给药后20min,28min和26min血药浓度达峰值,分别为（27.75±10.12）、（32.69±10.11）和（34.17±8.82）ng·mL-1,AUC0-∞值分别（4117.24±602.50）、（6057.11±2385.05）、（6404.59±2154.96）ng·min·mL-1,三种剂型鼻腔给药后血药浓度均远远低于静注后的血药浓度。对E2的三种不同鼻用剂型的脑靶向性进行了研究,采用人工脑脊液（CSF）推挽灌流法研究了大鼠鼻腔给予E2包合物溶液、壳聚糖纳米粒和亚微乳剂后,CSF中E2浓度的变化情况,并与静脉给药进行了比较。应用零净流量法测定了探针的体外回收率,体外探针的回收率为61.64%,在体外回收率测定的基础上,采用反向渗析法测定了体内回收率,体内回收率为41.7%。将测得的CSF数据进行了处理,结果显示,经鼻腔给药后,对于E2包合物、E2壳聚糖纳米粒和E2亚微乳剂这三种制剂而言,E2在CSF中的Tmax比静注给药的Tmax早,Cmax比静注给药的Cmax高,初步说明了E2可经嗅觉通路直接入脑。为了更加清楚地理解E2鼻腔给药后的鼻—脑直接转运,引入了脑靶向指数（DTI）和脑部药物直接转运百分比（DTP）两个指标,E2不同剂型鼻腔给药后的DTI均大于1,E2包合物、E2壳聚糖纳米粒和E2亚微乳剂三种制剂的DTI分别为2.61、3.15和3.80,表明E2不同剂型鼻腔给药有一定的靶向性,且靶向性强弱的顺序为:E2包合物＜E2壳聚糖纳米粒＜E2亚微乳剂。DTP分别为61.91%、68.43%和73.63%。通过达峰时间的提前、DTI和DTP的计算结果强烈支持E2自鼻腔向脑部转运存在直接通路,E2可经嗅觉通路直接入脑,且进一步说明了在促进E2由鼻粘膜向脑组织转运方面,三种制剂的先后顺序为:E2亚微乳剂＞E2壳聚糖纳米粒＞E2包合物。

全文目录


中文摘要  14-17
英文摘要  17-20
前言  20-29
  1. 课题背景  20-21
  2. 鼻腔给药治疗脑部疾病的理论基础  21-23
  3. 影响药物鼻腔吸收主要因素有  23-24
  4. 鼻腔给药的剂型  24
  5. 壳聚糖的研究概况  24-25
  6. 亚微乳剂载药体系  25-26
  7. 课题的主要研究内容  26
  参考文献  26-29
第一章 雌二醇体外分析方法的建立及处方前理化性质研究  29-35
  1.体外分析方法  29-32
    1.1 紫外光谱扫描  29
    1.2 色谱条件  29
    1.3 溶液的配制  29
    1.4 方法专属性  29-31
    1.5 标准曲线  31
    1.6 方法精密度和准确度  31
    1.7 回收率测定  31-32
  2.E_2在水溶液中的溶解度测定  32
  3.E_2在油中溶解度的测定  32-33
  4.E_2在不同介质中的油/水的分配系数的测定  33-34
  5.小结  34
  参考文献  34-35
第二章 雌二醇鼻用壳聚糖纳米粒制备工艺研究及体外性质考察  35-49
  1.仪器与试药  36
  2.方法  36-40
    2.1 雌二醇包合物的制备  36-37
    2.2 鼻用壳聚糖纳米粒的制备  37
    2.3 鼻用壳聚糖纳米粒的制备工艺筛选  37-38
    2.4 形态观察  38
    2.5 雌二醇鼻用壳聚糖纳米粒的粒径及粒度分布测定  38-39
    2.6 雌二醇鼻用壳聚糖纳米粒ξ-电位的测定  39
    2.7 纳米粒中药物含量及包封率的测定  39-40
      2.7.1 HPLC色谱条件  39
      2.7.2 测定方法  39-40
        2.7.2.1 含量测定  39
        2.7.2.2 包封率和载药量测定  39-40
  3.结果与讨论  40-46
    3.1 E_2鼻用壳聚糖纳米粒制备工艺的研究  40-43
      3.1.1 壳聚糖和三聚磷酸钠浓度的影响  40-41
      3.1.2 壳聚糖和三聚磷酸钠质量比的影响  41-42
      3.1.3 滴加速度的影响  42-43
      3.1.4 搅拌速度的影响  43
      3.1.5 温度的影响  43
      3.1.6 pH值的影响  43
    3.2 E_2鼻用壳聚糖纳米粒制备工艺的确立  43-44
    3.3 形态观察  44
    3.4 雌二醇鼻用壳聚糖纳米粒的粒径及粒度分布测定结果  44-45
    3.5 雌二醇鼻用壳聚糖纳米粒ξ-电位的测定结果  45-46
    3.6 纳米粒中药物含量及包封率的测定结果  46
      3.6.1 药物浓度对纳米粒包封率的影响  46
      3.6.2 三批样品含量及包封率测定结果  46
  4.小结  46-47
  参考文献  47-49
第三章 雌二醇鼻用亚微乳剂制备工艺研究及体外性质考察  49-71
  1.仪器与试药  49-50
  2.方法  50-55
    2.1 基本处方及制备工艺  50
    2.2 制备工艺的考察  50-51
      2.2.1 乳化设备的选择  51
      2.2.2 高压均质过程的优化  51
    2.3 E_2-SE物理化学性质考察  51-55
      2.3.1 粒径及ζ-电位的测定  51-52
      2.3.2 稳定性参数Ke的测定  52-53
      2.3.3 药物含量及包封率的测定  53-55
        2.3.3.1 载药量测定  53
        2.3.3.2 包封率测定  53-55
  3.结果与讨论  55-68
    3.1 亚微乳剂的微观结构  55-56
    3.2 处方因素考察  56-61
      3.2.1 油相的用量及组成  56
      3.2.2 混合乳化剂及其用量的选择  56-60
        3.2.2.1 乳化剂总量的影响  57-59
        3.2.2.2 乳化剂组成的影响  59-60
      3.2.3 稳定剂的选择  60-61
      3.2.4 E_2鼻用亚微乳剂处方的最终确立  61
    3.3 制备工艺考察  61-66
      3.3.1 初乳制备温度的选择  61-62
      3.3.2 乳化剂加入方法的选择  62
      3.3.3 搅拌强度及搅拌时间的选择  62-64
      3.3.4 均质压力的考察  64-65
      3.3.5 均质次数的考察  65-66
    3.4 pH对亚微乳剂稳定性的影响  66-67
    3.5 E_2鼻用亚微乳剂制备工艺的确立  67
    3.6 E_2鼻用亚微乳剂稳定性评价及理化性质考察  67-68
      3.6.1 粒径大小  68
      3.6.2 ξ-电位  68
      3.6.3 载药量以及包封率  68
  4.小结  68-69
  参考文献  69-71
第四章 雌二醇鼻用壳聚糖纳米粒和亚微乳剂鼻腔吸收的研究  71-84
  1.仪器与试药  71-72
  2.方法  72-74
    2.1 实验动物模型及实验装置  72-73
    2.2 鼻腔吸收溶液的制备及相关性质的考察  73
      2.2.1 E_2鼻用壳聚糖纳米粒溶液的制备  73
      2.2.2 E_2鼻用亚微乳剂的制备  73
      2.2.3 药液渗透压的调节  73
    2.3 药液中E_2含量的测定  73-74
      2.3.1 鼻腔分泌物对含量测定的影响  73
      2.3.2 灌流液中药物含量测定  73-74
      2.3.3 E_2在鼻粘液中的稳定性考察  74
    2.4 E_2壳聚糖纳米粒和E_2亚微乳剂鼻粘膜吸收规律研究  74
  3.结果与讨论  74-81
    3.1 鼻腔粘膜的生理特性  75
    3.2 在体循环实验条件的选择  75
    3.3 鼻腔分泌物对含量测定的影响结果  75
    3.4 E_2在鼻粘液中的稳定性考察结果  75
    3.5 E_2鼻粘膜经时吸收量的计算  75-76
    3.6 不同浓度的E_2壳聚糖纳米粒鼻粘膜吸收规律研究  76-78
    3.7 不同浓度E_2亚微乳剂鼻粘膜吸收规律研究  78-81
  4.小结  81-82
  参考文献  82-84
第五章 雌二醇鼻用壳聚糖纳米粒和亚微乳剂药物动力学研究  84-100
  1.仪器、试药与实验动物  84-85
  2.方法与结果  85-96
    2.1 实验动物模型的建立  85
    2.2 血浆中雌二醇RP-HPLC荧光测定方法的建立  85-87
      2.2.1 检测波长的确定  85
      2.2.2 色谱条件  85
      2.2.3 内标溶液的配制  85
      2.2.4 血浆样品处理  85
      2.2.5 方法专属性  85-86
      2.2.6 标准曲线的绘制  86
      2.2.7 方法精密度考察  86-87
      2.2.8 回收率实验  87
      2.2.9 样品稳定性实验  87
    2.3 样品的配制  87
    2.4 给药方案与样品采集  87-88
      2.4.1 鼻腔给药方法、血浆及CSF样品的采集  87-88
      2.4.2 静脉给药方法、血浆及CSF样品的采集  88
    2.5 药物动力学实验结果  88-92
    2.6 平均血药浓度-时间曲线  92-93
    2.7 药物动力学参数计算  93-96
  3.讨论  96-98
  4.小结  98
  参考文献  98-100
第六章 雌二醇鼻用壳聚糖纳米粒和亚微乳剂脑靶向性研究  100-128
  1.仪器、试药与实验动物  101-102
  2.微渗析技术简介  102-103
    2.1 微渗析系统简介  102
    2.2 微渗析技术的特点  102-103
  3.方法与结果  103-117
    3.1 样品的配制  103
      3.1.1 人工脑脊液的配制  103
      3.1.2 E_2包合物溶液的配制  103
      3.1.3 E_2壳聚糖纳米粒的配制  103
      3.1.4 E_2亚微乳剂的配制  103
    3.2 RP-HPLC荧光法测定CSF中E_2的含量  103-107
      3.2.1 检测波长的确定  103
      3.2.2 色谱条件  103
      3.2.3 方法专属性  103-104
      3.2.4 标准曲线的绘制  104
      3.2.5 方法精密度考察  104-105
      3.2.6 样品稳定性实验  105
      3.2.7 体外回收率测定(体外校正)  105-107
        3.2.7.1 体外回收率测定方法  106
        3.2.7.2 流速对回收率的影响  106
        3.2.7.3 浓度对回收率的影响  106
        3.2.7.4 零净流量法测定探针体外回收率  106-107
    3.3 体内微渗析试验  107-117
      3.3.1 探针的植入  107-108
      3.3.2 反向渗析法测定探针的体内回收率(体内校正)  108-109
      3.3.3 大鼠鼻腔给药血浆及CSF样品采集  109
      3.3.4 大鼠静脉给药血浆及CSF样品采集  109
      3.3.5 实验结果  109-115
        3.3.5.1 E_2包合物脑脊液数据  109-111
        3.3.5.2 E_2壳聚糖纳米粒脑脊液数据  111-113
        3.3.5.3 E_2亚微乳剂脑脊液数据  113-115
      3.3.6 E_2鼻用制剂脑靶向性评价  115-117
  4.讨论  117-123
  5.小结  123
  参考文献  123-128
全文结论  128-131
致谢  131-132
攻读学位期间发表论文情况  132-133
发表文章  133-149

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