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分子模拟辅助研究氨苄青霉素残留快速检测免疫传感器的特异性

作　者: 王明华
导　师: 王剑平
学　校: 浙江大学
专　业: 生物系统工程
关键词: 分子模拟压电免疫传感器蛋白-蛋白相互作用氨苄青霉素特异性自组装膜
分类号: TP212.3
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

动物性食品的营养丰富且易于人体消化吸收,具有极高的营养价值,随着社会和科技的发展,动物性食品的消费需求迅速增长。动物性食品生产依赖于畜牧养殖业的发展水平,先进的遗传育种与养殖技术为提高动物性食品产量提供了前提条件的同时又带来了人们更加关注的食品安全问题,兽药残留问题尤为突出。免疫传感器作为一种检测分析方法,主要以其快速简便的优点,得到了研究和应用领域的广泛关注,其从研究到应用的关键是要获得传感器稳定的性能表现。生物传感器所倚赖的特异性生物反应本身以及生物分子与传感器结合,都极易受到环境因素的影响,从而影响其性能。分子模拟是依赖于量子力学、分子力学用计算机来构造、实现、分析和存储复杂的分子模型,计算微观粒子之间的相互作用,在分子或原子水平上进行的科研。该方法具有成本低、安全性高、可深入研究问题等优点,在众多研究领域体现出了应用潜力。本研究以动物性食品安全问题中的青霉素兽药残留快速检测免疫传感器为研究目标,主要关注直接固定抗体直接检测方法的性能稳定性。针对该方法中固定抗体的活性和稳定性确证,采用分子模拟的研究方法对其可能的影响操作步骤和检测条件——牛血清蛋白封闭的过程进行深入探索,以期改进免疫传感器的构建方式,有助于获得较稳定的性能。免疫传感器采用硫辛酸自组装单分子层膜将氨芐青霉素抗体固定于压电金电极上作为生物识别元件、以石英晶体微天平作为检测器构建,对不同封闭过程产生的影响进行研究。比较免疫传感器实物试验与分子模拟的研究结果,同时,也对分子模拟在生物传感器研究和应用中其他建立和检测步骤的应用可行性进行评价。主要研究内容如下：(1)选择了三种基于网络平台的不同蛋白-蛋白相互作用模拟预测方法FiberDock (http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/FiberDock), ClusPro(http://cluspro.bu.edu/), GRAMM-X (http://vakser.bioinformatics.ku.edu/resources/gramm/grammx),对氨芐青霉素抗体活性部位与人血清蛋白、卵白蛋白之间的相互作用进行模拟。这三种方式都可以对含有多条肽链的蛋白质之间的相互作用完整表现。结果表明,对于本研究中氨芐青霉素抗体与HSA、OVA相互作用的模拟预测,三种分析方法都可用于模拟研究,结果均表明了氨芐青霉素抗体与HSA、OVA有发生非特异性相互作用的可能性。三种方法的模拟研究结果之间具有一定相似性和一致性。(2) ZDOCK程序是一种采用快速傅里叶变换算法的蛋白-蛋白相互作用模拟研究程序,可对不同蛋白单条多肽链之间的相互作用进行研究。对包含抗体活性中心的A链与人血清蛋白A链、卵白蛋白A链,以及不含抗体活性中心的抗体B链与人血清蛋白A链之间的相互作用进行模拟,并与溶菌酶及其抗体之间的特异性相互作用模拟结果进行比较分析。模拟研究结果表明抗体活性中心所在的A链与人血清蛋白A链发生非特异性相互作用的几率大于B链和卵白蛋白A链,这可能与抗体制备过程采用牛血清蛋白作为氨芐青霉素偶联蛋白有关。与溶菌酶及其抗体的特异性相互作用模拟结果对照表明,蛋白-蛋白相互作用模拟预测方法可用于深入了解抗体的特异性。(3)将氨芐青霉素抗体序列与蛋白质数据库PDB中收入的其它抗体序列通过BLAST序列比对氨芐青霉素抗体的抗原结合区域进行了确证,结果表明氨芐青霉素抗体A链模拟结果构象中参与形成对接复合物的区域,大部分是位于抗体结构中的高度可变区域中与抗体特异性密切相关的关键氨基残基。(4)对硫辛酸自组装单分子层膜将抗体固定于压电金电极表面作为生物识别元件、石英晶体微天平为检测器的氨芐青霉素检测免疫传感器建立过程中,固定抗体后采用不同浓度、时间的牛血清蛋白封闭进行研究。结果表明固定抗体后采用牛血清蛋白进行封闭,修饰电极表面结合牛血清蛋白的质量表现出了浓度和时间的依赖性；电极表面的活化羧基连接位点上,牛血清蛋白结合量不随固定抗体质量增加而减少,表明氨芐青霉素抗体与牛血清蛋白之间有发生非特异性相互作用的可能性。(5)对采用不同试剂和牛血清蛋白不同时间、浓度封闭处理的免疫传感器进行了检测氨芐青霉素试验。结果表明免疫传感器构建中,采用BSA封闭处理时,BSA与抗体修饰电极结合量较少的处理,其对氨芐青霉素的检测性能优于BSA结合量较多的处理。

全文目录

致谢  6-7
摘要  7-9
Abstract  9-11
目录  11-14
擂图清单  14-16
表格清单  16-17
英文缩略表  17-20
第一章前言  20-29
  1.1 动物性食品及其安全问题  20-23
    1.1.1 动物性食品的营养价值  20-21
    1.1.2 动物性食品安全的影响因素  21-23
  1.2 兽药残留的危害  23-25
    1.2.1 对人民身体健康的威胁  23-24
    1.2.2 对生态环境的潜在危害  24-25
    1.2.3 对国民经济的发展产生重要影响  25
  1.3 动物性食品安全保障措施研究进展  25-27
    1.3.1 动物性食品安全的相关立法  25-26
    1.3.2 兽药残留检测技术发展状况  26-27
  1.4 高效兽药残留检测仪器和技术的开发是解决问题的关键  27-29
第二章生物传感器检测青霉素残留的研究进展  29-44
  2.1 青霉素  29-31
    2.1.1 青霉素的性质及作用原理  29-30
    2.1.2 动物性食品中青霉素残留的来源  30-31
  2.2 检测青霉素残留的生物传感器研究进展  31-40
    2.2.1 酶生物传感器  31-32
    2.2.2 受体蛋白生物传感器  32-33
    2.2.3 免疫生物传感器  33-35
    2.2.4 影响生物传感器性能的因素  35-40
  2.3 生物传感器研究中的新方法  40-42
  2.4 本课题研究的意义  42-44
    2.4.1 研究内容  43
    2.4.2 研究目标  43-44
第三章分子模拟基本理论体系及其在生物传感器研究中的应用  44-57
  3.1 计算机分子模拟  44-50
    3.1.1 力场  45-46
    3.1.2 分子对接法的基本原理  46-47
    3.1.3 分子动力学模拟  47-49
    3.1.4 商业化大型分子模拟软件  49-50
  3.2 计算机模拟与生物传感器  50-56
    3.2.1 生物大分子的吸附  50-52
    3.2.2 蛋白-配体相互作用原理研究  52-53
    3.2.3 流动、扩散过程的数学模拟  53-54
    3.2.4 生物大分子设计筛选  54-55
    3.2.5 蛋白-配体复合物的pH依赖性研究  55-56
  3.3 本章小结  56-57
第四章分子模拟辅助研究固定抗体特异性  57-74
  4.1 分子模拟研究方法  57-58
  4.2 结果与讨论  58-72
    4.2.1 蛋白-蛋白对接模拟  58-71
    4.2.2 BLAST蛋白质序列比对分析抗体对接复合物  71-72
  4.3 本章小结  72-74
第五章基于石英晶体微天平(QCM)生物传感器试验的氨芐青霉素抗体特异性研究  74-95
  5.1 QCM生物传感器检测原理  74-76
    5.1.1 压电石英晶体微天平(QCM)原理  74-75
    5.1.2 免疫反应的生物学原理  75
    5.1.3 电化学循环伏安测试原理  75
    5.1.4 免疫传感器构建原理  75-76
  5.2 材料与方法  76-80
    5.2.1 试验试剂及仪器  76-77
    5.2.2 试验方法  77-80
  5.3 结果与讨论  80-93
    5.3.1 电极清洗  80-82
    5.3.2 硫醇自组装单分子层膜修饰电极金表面  82-83
    5.3.3 EDC、NHS活化硫醇自组装单分子层膜  83-84
    5.3.4 抗体浓度对固定的影响  84-86
    5.3.5 BSA封闭对氨芐青霉素抗体的影响  86-91
    5.3.6 免疫传感器检测氨芐青霉素  91-93
  5.4 本章小结  93-95
第6章结论和展望  95-100
  6.1 创新点及结论  95-97
  6.2 研究展望  97-100
参考文献  100-119
附录  119

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