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猪带绦虫六钩蚴TSOL18抗原表位及组织定位的研究

作　者: 郭爱疆
导　师: 才学鹏；吴润
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪带绦虫 六钩蚴 TSOL18 单克隆抗体 噬菌体展示技术 抗原表位 抗原定位
分类号: R392
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


囊尾蚴病是由猪带绦虫的幼虫——囊尾蚴寄生于人或猪而引起的人畜共患寄生虫病,该病不仅给畜牧业造成一定的经济损失,而且还威胁着人类健康,是经济落后国家和地区重要的公共卫生问题。TSOL18是猪带绦虫六钩蚴阶段特异性表达的抗原,主要在六钩蚴入侵中间宿主的早期阶段分泌,其免疫血清在体外能有效杀死六钩蚴,体外表达的重组TSOL18能完全保护猪不被猪带绦虫虫卵感染。随着免疫学的发展,人们认识到有效的保护是抗原表位的参与。因此,阐明猪带绦虫TSOL18蛋白的抗原表位和组织分布对于该病的新型诊断试剂以及分子疫苗设计方面意义重大。本研究挑取实验室保存的重组菌株Pichia pastoris pPIC9K-TSOL18进行5L发酵罐发酵培养,甲醇诱导72 h后将表达上清液进行SDS-PAGE,用薄层扫描分析,目的蛋白约占上清总蛋白含量的80%以上,目的蛋白表达量达2.00g/L。重组蛋白TSOL18经Sephadex G-100分子筛凝胶层析纯化后,其纯度达90%,满足制备单抗的抗原要求。将纯化的TSOL18作为免疫原,制备了12株可分泌TSOL18单克隆抗体的杂交瘤细胞株,经分型试纸条鉴定,12株单抗分属于IgG1、IgG2a、IgG2b、IgM抗体亚型,轻链均为K型；ELISA叠加试验表明,12株单抗分别识别2个不同抗原表位,2株不同抗原表位单克隆抗体的腹水效价分别达1×102和1×106；杂交瘤细胞株的染色体组型、单抗的稳定性等的分析表明,所获得的12株单抗均能稳定分泌,满足常规实验的要求。采用次氯酸钠溶液、胆汁和胰酶获得激活的六钩蚴,虫卵的脱壳率为95%,六钩蚴的活力为72%,然后用TSOL18免疫的猪血清和TSOL18单抗对激活的六钩蚴分别进行体外杀伤实验,台盼蓝染色判定六钩蚴活力。结果证实在有补体的情况下,多抗和单抗6天时对六钩蚴的杀伤率分别为73%和52%。为了分析单抗的抗原结合位点,本研究利用TSOL18单克隆抗体筛选噬菌体随机12肽库,通过四轮“吸附-洗脱-扩增”的亲和筛选,对噬菌体12肽库进行了富集。随机挑取的59个噬斑提取DNA后测序,根据测序结果推导出的TSOL18单抗识别的表位氨基酸序列分别为ETTKLQRFQAML (L1)和DHTLF (L2),两个序列出现频率分别是83%和15%。ELISA方法检测噬菌体克隆与单抗MAb或BSA的结合反应表明,两个表位均与单抗特异性结合。在验证噬菌体蛋白抑制实验中,加入不同滴度的纯化噬菌体Ll或L2克隆,以阻断TSOL18 MAb与TSOL18抗原的结合,结果显示,随着噬菌体滴度的降低,对TSOL18 MAb与TSOL18抗原结合的抑制率也逐渐降低,呈剂量效应关系。将筛选出的特异性噬菌体克隆大量扩增,纯化蛋白免疫小鼠,检测血清与TSOL18蛋白的反应性。ELISA结果显示,筛选的两个表位均能与TSOL18抗原发生反应。同时用两个表位作抗原检测表位与TSOL18免疫的猪血清的反应性。ELISA结果显示,两个表位均与被检血清反应。用筛选到的表位检测猪囊尾蚴病血清,ELISA敏感性分别为85%(L1)和79%(L2)。利用噬菌体展示技术筛选TSOL18抗原表位为猪囊尾蚴病免疫和诊断技术的进一步研究奠定了基础。采用胶体金标记技术对猪带绦虫六钩蚴宿主保护性抗原TSOL18进行定位,发现金颗粒沉积于小钩、穿刺腺细胞的细胞质和分泌颗粒周围,而对照血清的六钩蚴胶体金染色未见特异性金颗粒沉积。

全文目录


摘要  5-7
SUMMARY  7-13
第一章 文献综述  13-38
  丝状噬菌体展示技术在寄生虫学中的应用  13-23
    1 丝状噬菌体展示技术概述  13-14
    2 丝状噬菌体展示技术在寄生虫病研究中的应用  14-19
    3 丝状噬菌体展示技术在寄生虫病研究中的意义  19
    参考文献  19-23
  猪囊尾蚴病的研究进展  23-38
    1 免疫学诊断研究进展  23-25
    2 疫苗研究进展  25-29
    3 展望  29
    参考文献  29-38
第二章 猪带绦虫六钩蚴TSOL18蛋白的高效表达及与纯化  38-46
  1 材料与方法  39-42
    1.1 材料  39-40
    1.2 方法  40-42
  2 结果  42-43
    2.1 发酵罐水平重组蛋白的表达  42
    2.2 重组蛋白TSOL18的纯化  42-43
  3 讨论  43-46
    3.1 带科绦虫六钩蚴抗原的特点  43-45
    3.2 表达系统的选择  45
    3.3 目的蛋白的大量表达与纯化  45-46
第三章 猪带绦虫六钩蚴TSOL18单克隆抗体的制备  46-67
  1 材料与方法  46-54
    1.1 材料  46-48
    1.2 方法  48-54
  2 结果  54-60
    2.1 间接ELISA法最佳抗原包被量及阳性血清稀释滴度的确定  54-55
    2.2 免疫Balb/c小鼠血清抗体的检测结果  55-56
    2.3 杂交瘤细胞株的建立  56
    2.4 单抗特性鉴定  56-59
    2.5 腹水效价的测定  59
    2.6 腹水单抗的纯化  59-60
    2.7 单克隆抗体特异性检测  60
  3 讨论  60-67
    3.1 抗原  61
    3.2 动物选择和免疫  61-62
    3.3 饲养细胞的制备  62
    3.4 杂交瘤细胞融合  62-63
    3.5 杂交瘤抗体的检测  63-64
    3.6 克隆化  64
    3.7 单克隆抗体亚类  64-65
    3.8 杂交瘤细胞的染色体  65
    3.9 腹水的制备  65
    3.10 单克隆抗体的纯化  65-66
    3.11 TSOL18单抗的应用  66-67
第四章 TSOL18单抗对猪带绦虫六钩蚴作用的研究  67-77
  1 材料与方法  68-70
    1.1 材料  68-69
    1.2 方法  69-70
  2 结果  70-73
    2.1 虫卵的观察  70
    2.2 虫卵孵化和激活过程的观察  70
    2.3 孵化率、激活率分析  70-71
    2.4 体外杀伤六钩蚴实验  71-73
  3 讨论  73-77
    3.1 虫体的孵化、六钩蚴的激活及活力鉴定  73-75
    3.2 补体的作用  75
    3.3 体外杀伤六钩蚴的实验结果  75-77
第五章 猪带绦虫六钩蜘TSLO81单抗识别的 抗原表位的研究  77-95
  1 材料与方法  77-86
    1.1 材料  77-79
    1.2 方法  79-86
  2 结果  86-90
    2.1 TSOL18单抗对噬菌体随机十二肽库的筛选  86-87
    2.2 氨基酸序列分析  87-88
    2.3 目的表位噬菌体的克隆与单抗的结合分析  88
    2.4 目的表位噬菌体克隆的竞争抑制实验  88
    2.5 抗血清与TSOL18蛋白的结合反应  88-89
    2.6 Western Blot检测噬菌体免疫小鼠血清与TSOL18蛋白的反应性  89
    2.7 筛选表位与TSOL18蛋白制备的多抗反应性检测  89-90
    2.8 噬菌体表位与猪囊尾蚴血清的反应性  90
  3 讨论  90-95
    3.1 丝状噬菌体表面展示随机肽库  90-91
    3.2 去污剂  91
    3.3 温度  91
    3.4 结合和洗脱时间  91
    3.5 靶分子的浓度  91-92
    3.6 淘选轮数  92-93
    3.7 噬菌体随机肽库  93-95
第六章 猪带绦虫六钩蚴TSOL18抗原组织定位的研究  95-101
  1 材料与方法  95-97
    1.1 材料  95-96
    1.2 方法  96-97
  2 结果  97-98
    TSOL18抗原的定位  97-98
  3 讨论  98-101
    3.1 免疫电镜技术  98-99
    3.2 带科绦虫六钩蚴阶段抗原的定位研究  99-101
第七章 全文结论  101-102
致谢  102-103
参考文献  103-117
作者简介  117-118
导师简介  118-119

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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