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FSH对子宫内膜的影响和调控机制
作 者: 张丹
导 师: 黄荷凤
学 校: 浙江大学
专 业: 妇产科学
关键词: 卵泡刺激素(FSH) FSH受体 促排卵 子宫内膜 水通道蛋白 容受因子 实时荧光定量PCR 蛋白印迹 免疫组织化学 免疫荧光 FSH PCMB AQPs 内膜容受性 胚胎着床 囊胚粘附模型 JAr粘附模型 siRNA 围绝经期 绝经 AQP2 增殖 凋亡 萎缩
分类号: R714.8
类 型: 博士论文
年 份: 2011年
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内容摘要
第一部分FSH促排卵对人子宫内膜AQPs和容受因子的影响目的:验证FSHR在人子宫内膜组织和内膜细胞系Ishikawa细胞的表达,探讨FSH促排卵对人子宫内膜形态、FSHR、AQPs和内膜容受因子表达的影响。材料与方法:收集促排卵(COS)妇女着床窗期子宫内膜15例、同期对照内膜40例,采用化学发光法检测血清FSH和E2水平;采用RT-PCR产物纯化克隆测序、蛋白免疫印记、免疫组织化学、细胞免疫荧光等方法全面验证人子宫内膜组织和细胞FSHR的表达。电镜观察两组子宫内膜形态和超微结构;蛋白免疫印记方法检测两组子宫内膜FSHR、水通道蛋白(AQP1、AQP2、AQP8)、内膜容受因子(Integrinβ3、LIF)、细胞紧密连接相关蛋白(Claudin4)的表达与改变。结果:人子宫内膜组织和子宫内膜细胞系Ishikawa细胞表达FSHR mRNA和蛋白,RT-PCR产物序列与NCBI数据库BLAST比对吻合率100%;蛋白表达主要定位于细胞膜和细胞浆COS妇女血清FSH和E2水平显著高于对照组。扫描电镜下见对照组内膜腔上皮排列有序、胞饮突形成,COS组内膜腔上皮细胞排列分布紊乱、未见明显胞饮突;透视电镜见COS组内膜上皮细胞凋亡增加,细胞紧密连接未见明显改变。COS组内膜组织FSHR蛋白表达显著上调,AQP1、AQP2、AQP8、Integrinβ3、LIF蛋白表达显著下调,Claudin4表达无显著改变。结论:FSHR表达于人子宫内膜组织和子宫内膜细胞系Ishikawa细胞。促排卵妇女血清FSH和E显著升高,内膜FSHR表达上调、AQP1、AQP2、AQP8、Integrinβ3、LIF蛋白表达下调,并致内膜腔上皮形态改变、凋亡增加。FSH可能通过FSHR直接调节育龄期子宫内膜形态和功能。第二部分FSH影响育龄期子宫内膜容受性的调控机制目的:以动物模型和体外模型为基础,研究FSH对育龄期子宫内膜容受性、胚胎着床的影响及可能机制。材料与方法:建立FSH促排卵小鼠动物模型,检测外源性FSH刺激对小鼠血FSH/E2水平、子宫内膜AQPs和着床容受因子、妊娠率和活产率的影响,创新性建立小鼠囊胚粘附模型、检测FSH/E2、PCMB (AQP抑制剂)预处理子宫内膜细胞对囊胚粘附着床的影响;同时进行体外细胞实验,采用RT-Real time PCR检测FSH/E2对AQPs、integrinB3、LIF等容受因子目的基因表达水平;采用ssiRNA干扰技术和JAr滋养细胞球粘附模型,检测AQP2/AQP8siRNA干扰后内膜容受因子的表达改变和JAr滋养细胞球粘附率的改变。结果:FSH促排卵组小鼠血FSH/E2水平显著增高,内膜AQP3、AQP2蛋白表达呈下调趋势、FSHR呈微弱上调趋势,妊娠率和活产率显著低于对照组。小鼠囊胚粘附模型实验显示,体外FSH、FSH/E及PCMB预处理子宫内膜细胞均导致囊胚48h和72h粘附率显著下降。E2对IK细胞AQP2和AQP8 mRNA呈浓度依赖性上调作用,FSH (0、1、3、10、30 IU/L)对IK细胞AQP2、AQP8和LIF mRNA呈浓度依赖性和时间依赖性下调作用,其中以10IU/L和301U/L浓度FSH在作用48hr时的下调作用最为显著。AQP2siRNA干扰后IK细胞着床因子LIF和Integrinβ3表达显著下调,OLFM1表达显著上调;AQP8siRNA干扰后LIF表达显著下调,OLFM1表达显著上调。子宫内膜细胞AQP8siRNA和AQP2siRNA干扰后,JAr滋养细胞团粘附率均显著下降。结论:超生理水平FSH通过下调育龄期子宫内膜AQPs、干扰内膜容受因子表达,进而影响子宫内膜对胚胎的容受性、不利于胚胎着床。第三部分长期高FSH刺激对绝经期 的学位论文">围绝经期子宫内膜萎缩的影响目的:通过在体组织、动物模型和体外细胞模型,探讨绝经后高FSH水平在子宫内膜功能及萎缩中所起的作用及其机制。材料与方法:采用化学发光法检测围绝经期和绝经后不同年龄段妇女血清FSH、LH、E2变化动态,免疫组织化学方法检测绝经后妇女和育龄期妇女子宫内膜FSHR、Ki67、AQP1、AQP2、AQP8蛋白表达。采用MTT法检测FSH对人原代培养子宫内膜腺上皮细胞和Ishikawa细胞增殖的影响,流式细胞仪检测FSH对Ishikawa细胞周期的影响,Real time PCR检测高浓度FSH对子宫内膜细胞AQP2和AQP8表达的影响、并检测AC激动剂和拮抗剂对FSH作用的影响。建立手术去势动物模型、药物去势动物模型和假手术(对照)动物模型,通过RIA方法检测血FSH和E2水平,采用透视电镜观察子宫内膜细胞形态和凋亡指征、Western blotting检测子宫内膜增殖和凋亡相关指标。结果:绝经后妇女血清FSH水平随年龄从41-50岁年龄段到61-70年龄段呈逐步上升,从61-70年龄段到71-80年龄段无显著上升。血清E2水平呈现与FSH同步的反向变化。与育龄期内膜相比,绝经后子宫内膜FSHR、AQP2和AQP1蛋白表达无显著改变,Ki67表达显著下降, AQP8蛋白间质表达较育龄期增高、腺体表达较育龄期降低。FSH对原代子宫内膜腺上皮细胞呈浓度依赖性的抑制增殖作用,但对Ishikawa细胞增殖和细胞周期无明显影响。高浓度FSH(50IU/L、100IU/L、200IU/L、400IU/L)呈浓度依赖性显著上调Ishikawa细胞AQP2 mRNA的表达,该上调作用可部分被SQ22536所拮抗。Forskolin可上调Ishikawa细胞AQP2 mRNA的表达。动物模型实验方面,成功建立了手术去势(OVX,高FSH、低E2)、药物去势(GnRHa,低FSH、低E2)和假手术对照组(SHAM, FSH和E2水平如常)小鼠。OVX组小鼠子宫萎缩明显、透视电镜下见大片凋亡细胞和散在凋亡小体,而GnRHa组小鼠子宫大小、萎缩度及细胞凋亡现象介于SHAM组和OVX组之间。与SHAM组相比,GnRHa组小鼠子宫C-FOS、C-JUN、Bcl-2蛋白表达量呈下降趋势。与SHAM组和GnRHa组相比,OVX组小鼠子宫C-FOS、C-JUN、Bcl-2蛋白表达显著下降,而Caspase3蛋白的表达显著增高。结论:绝经后循环高FSH水平可通过腺苷酸环化酶通路上调子宫内膜AQP2,抑制子宫内膜增殖、促进子宫内膜细胞凋亡,协同低E调节子宫内膜生理性萎缩。
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全文目录
致谢 5-8 中文摘要 8-12 Abstract 12-16 缩略词表 16-18 1. 引言 18-21 2. 第一部分 FSH促排卵对人子宫内膜AQPs和容受因子的影响 21-65 2.1 资料与方法 22-43 2.2 结果 43-57 2.3 讨论 57-60 2.4 结论 60-61 参考文献 61-65 3. 第二部分 FSH影响育龄期子宫内膜容受性的调控机制 65-93 3.1 材料和方法 66-74 3.2 结果 74-86 3.3 讨论 86-90 3.4 结论 90-91 参考文献 91-93 4. 第三部分 长期高FSH刺激引起绝经期 的学位论文">围绝经期子宫内膜萎缩的机制研究 93-117 4.1 材料和方法 94-100 4.2 结果 100-110 4.3 讨论 110-114 4.4 结论 114-115 参考文献 115-117 综述一 117-129 参考文献 123-129 综述二 129-140 参考文献 136-140 作者简历及在读期间所取得的科研成果 140-142
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中图分类: > 医药、卫生 > 妇产科学 > 产科学
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