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兔舍环境真菌气溶胶及其向环境的传播

作　者: 苗增民
导　师: 柴同杰
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 兔舍环境真菌气溶胶 ERIC-PCR 传播模式荧光定量PCR
分类号: S858.291
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

养殖环境是真菌气溶胶的重要来源,而且养殖环境中的许多气载真菌可引起畜禽发生多种真菌病,其普遍存在已对畜禽养殖业构成巨大威胁。我国已成为世界兔业大国,但是对兔舍环境中真菌气溶胶的组成、含量变化以及气载病原真菌的传播还未见系统的研究。众所周知,一些气载病原微生物,如细菌,病毒和真菌,能够通过空气传播很远的距离,造成传染病的流行。过去对畜禽养殖环境中微生物气溶胶传播的研究主要是通过舍内外环境中细菌浓度的变化、细菌耐药性及某些致病菌含量等方面来确认的。然而,未能证明舍内外环境中分离到的微生物气溶胶的起源及其同源性,没能获得充分的证据证明畜禽舍微生物气溶胶向环境的传播。为此,本课题从2007年6月到2008年5月对两种不同结构兔舍(封闭式和半封闭式)环境中的气载真菌进行了为期一年的检测:(1)检测气载真菌的含量、粒径分布、含量变化及优势菌属;(2)利用ERIC-PCR对不同结构兔舍环境中的气载真菌的组成进行比较;(3)根据ITS序列的特异性,对兔源,人源和气载的病原真菌进行同源性鉴定;(4)利用荧光定量PCR对气载烟曲霉进行准确的定量。1不同结构兔舍环境中真菌气溶胶的组成、含量变化及其优势菌属本实验采用ANDERSEN-6级空气微生物收集器历时一年(2007.6-2008.5)采集1个封闭式和1个半封闭式兔舍环境中的气载真菌。通过对兔舍环境中气载真菌含量、变化、优势菌属以及它们在Andersen六级采样器上的分布规律来推断其对饲养员及动物自身可能造成的危害。研究结果表明,(1)在所检测的兔舍环境中气载真菌粒子浓度要远远高于一般的自然环境,而且大部分粒子的空气动力学直径较小(<2.5μm),更容易进入呼吸道深部。虽然我们没有对养殖环境的动物及饲养员的健康作系统的调查,但是长期处在这种高浓度的真菌气溶胶环境下,很有可能导致慢性呼吸道疾病或增加其它疾病的易感性;(2)通过分析一年中气载真菌的浓度变化发现,月平均浓度最高的是10月,最低的是1月,气溶胶的月平均浓度变化差异显著(P<0.05);一天中,早上09:00的浓度最高,并且一天中浓度的变化表现为09:00>17:00>13:00;(3)历时一年,于青岛兔场共获得6523个菌落的纯培养,经形态学研究,鉴定出19个属,47种空气真菌,优势菌属分别是枝孢属,青霉属,曲霉属和链格孢。(4)饲养密度大时真菌气溶胶浓度相对较高,真菌粒子比细菌更易进入呼吸道深部,兔舍中孢子粒径0.65-2.1μm范围内的真菌浓度均高于其它检测的养殖环境,而且与人和动物健康密切相关的致病类群Aspergillus在所有鉴定真菌类群中所占的比例很高,这表明,养殖环境中真菌气溶胶已成为自然界的重要污染源,对人和动物健康造成的危害应该给予足够的重视。2利用ERIC-PCR比较不同结构兔舍环境的真菌气溶胶的组成本研究选用AGI-30空气采样器,分别收集9个封闭式兔舍和8个半封闭式兔舍环境中的空气样品,在不经过培养的条件下直接提取DNA,用ERIC-PCR的通用引物进行扩增得到ERIC-PCR的指纹图谱,借助于计算机软件进行不同结构兔舍环境中气载真菌含量和组成差异的比较。ERIC-PCR结果表明,封闭式兔舍环境中气载真菌菌群多样性较丰富,而半封闭式兔舍的真菌菌群数目较少,同时,半封闭式兔舍的真菌菌群之间的相似性高于封闭式兔舍之间的相似性。长期处于高浓度真菌环境中会出现慢性亚临床症状出现,如厌食、生长缓慢、免疫失败等,采样的封闭式兔舍已经发现类似病例出现,这些都警示人们应对兔舍气载真菌及其毒素的危害给予足够的重视。3通过ITS序列对兔舍环境中须癣毛癣菌气源性传播的推测本实验首先收集兔舍内气载须癣毛癣菌及被感染的饲养人员体表和病兔体表须癣毛癣菌,在形态学鉴定的基础上,通过比较ITS的序列对分离的须癣毛癣菌进行同源性鉴定,确定兔舍真菌气溶胶的气源性传播。结果表明,在本实验中所采集到的不同来源的须癣毛癣菌的ITS区域具有相同的DNA序列,由此可见:从舍内空气中和发病饲养员身体上分离到的这些须癣毛癣菌是由来自兔体的同一菌株繁殖而来,也就是说,兔体上的须癣毛癣菌可以形成气溶胶污染舍内空气,并通过空气接触感染饲养人员。4荧光定量PCR检测兔舍环境气载烟曲霉的含量为了准确的定量兔舍环境中气载烟曲霉的含量并评估其风险,本实验以兔舍为研究对象,用AGI-30收集兔舍环境中的空气样品,对样品同时进行培养法和荧光定量的方法对气载烟曲霉的含量进行检测。结果显示,荧光定量PCR所测的三个兔舍(A、B、C)的气载烟曲霉的平均浓度分别是3.0×10~3、3.3×10~3和1.5×10~3(spores/m~3 air),培养法则为2.5×10~2、2.8×10~2和1.1×10~2(CFU/m~3 air),荧光定量PCR方法检测的气载烟曲霉浓度大约是培养方法的12-14倍。因此,传统的培养计数法低估了气载真菌的真实浓度;所以,仅仅依靠培养法来检测畜禽舍环境中微生物气溶胶含量,评估其健康风险是不充分的。

全文目录

中文摘要  14-16
英文摘要  16-19
文献综述  19-30
  1 微生物气溶胶的概述  19
    1.1 微生物气溶胶的概念  19
    1.2 真菌气溶胶的概念  19
    1.3 可吸入真菌气溶胶  19
    1.4 气载真菌毒素  19
  2 真菌气溶胶的危害  19-21
    2.1 真菌病  19
    2.2 真菌感染  19-20
    2.3 过敏  20-21
    2.4 炎症反应  21
  3 真菌气溶胶的检测  21-25
    3.1 惯性撞击类  21-24
      3.1.1 自然沉降法  21-22
      3.1.2 射流撞击式采样器(裂隙式采样器)  22-23
      3.1.3 离心撞击式采样器  23-24
    3.2 过滤阻留类  24
    3.3 静电沉着类  24
    3.4 温差迫降类  24-25
    3.5 生物类  25
    3.6 采样器的选择  25
    3.7 空气微生物采样发展趋势  25
  4 微生物气溶胶学的应用  25-26
    4.1 应用于动物疫病防治方面  25-26
    4.2 应用于植物疫病防治方面  26
  5 微生物气溶胶传播机制的研究  26-27
  6 微生物气溶胶的研究现状  27-28
    6.1 微生物气溶胶的国内研究现状  27
    6.2 微生物气溶胶的国外研究现状  27-28
  7 研究的目的及意义  28-29
  8 本论文的整体构思和体系结构  29-30
第一部分不同结构兔舍环境真菌气溶胶的组成、含量变化及其优势菌属  30-54
  1 引言  30-35
    1.1 捕获空气中真菌的方法  30
    1.2 Andersen-6 级生物采样器概述  30-31
    1.3 工作原理  31-32
    1.4 Andersen 采样器特点  32
      1.4.1 采集粒谱广  32
      1.4.2 采集效率高  32
    1.5 真菌气溶胶的浓度  32-34
      1.5.1 真菌气溶胶浓度受环境因素的影响  32-33
      1.5.2 真菌气溶胶危害与浓度密切相关  33
      1.5.3 真菌气溶胶的组成  33-34
    1.6 真菌气溶胶的危害  34-35
  2. 材料与方法  35-37
    2.1 材料和仪器  35
      2.1.1 动物舍情况  35
      2.1.2 沙堡弱培养基  35
      2.1.3 主要仪器和设备  35
    2.2 方法  35-37
      2.2.1 实验设计  35-36
      2.2.2 兔舍内外环境中空气样品的采集  36
      2.2.3 空气中真菌浓度计算  36
      2.2.4 优势空气真菌的鉴定  36
      2.2.5 空气真菌粒径分布  36
      2.2.6 数据统计  36-37
  3. 结果  37-51
    3.1 半封闭式兔舍环境中气载真菌的特点  37
    3.2 封闭式兔舍环境中气载真菌的特点  37-38
    3.3 气载真菌的组成  38-40
    3.4 真菌粒径的分布特征  40-41
    3.5 真菌气溶胶种级形态特征  41-51
  4. 讨论  51-53
    4.1 养殖环境的真菌是大气重要污染源之一  51-52
    4.2 优势真菌类群的潜在危害  52
    4.3 真菌气溶胶浓度的变化  52
    4.4 真菌粒子比细菌更易进入呼吸道深部  52-53
  5. 结论  53-54
第二部分利用 ERIC-PCR 比较不同结构兔舍环境的真菌气溶胶的组成  54-62
  1 引言  54-58
    1.1 AGI-30 采样仪器工作原理与结构  54
    1.2 AGI-30 采样器特点  54
    1.3 ERIC 序列  54-55
    1.4 ERIC 结构特征及功能  55
    1.5 ERIC-PCR 的原理及特点  55-56
    1.6 ERIC-PCR 产物形成规律  56
    1.7 ERIC-PCR 技术的应用  56-57
    1.8 存在的问题和展望  57
    1.9 研究的目的及意义  57-58
  2. 材料和方法  58-60
    2.1 试验仪器  58
    2.2 实验试剂  58
    2.3 DNA 提取液  58-59
    2.4 方法  59-60
      2.4.1 ERIC-PCR 引物序列  59
      2.4.2 ERIC-PCR 反应体系  59
      2.4.3 最佳扩增程序  59
      2.4.4 ERIC-PCR 图谱的试验数据处理  59-60
  3 结果  60-61
    3.1 ERIC-PCR 结果  60
    3.2 聚类分析结果  60-61
  4 讨论  61
  5 结论  61-62
第三部分通过ITS 序列对兔舍环境中气载须癣毛癣菌气源性传播的推测  62-72
  1 引言  62-66
    1.1 兔皮肤真菌病  62
    1.2 兔皮肤真菌病在国内外的流行情况  62-63
    1.3 国内外对兔皮肤真菌病的研究重点  63
    1.4 国内外对兔皮肤真菌病传播途径的研究  63-64
    1.5 气源性传播存在的可能性  64
    1.6 传统的真菌分类鉴定  64
    1.7 分子生物学技术在真菌分类中的应用  64-65
    1.8 核糖体RNA 基因间隔区ITS 在真菌分子生物学鉴定和分型中的应用  65-66
    1.9 研究的目的及意义  66
  2. 材料和方法  66-69
    2.1 材料  66-67
      2.1.1 实验真菌菌株  66
      2.1.2 培养基  66
      2.1.3 试剂  66-67
    2.2 方法  67-69
      2.2.1 氯化苄法提取DNA  67-68
      2.2.2 PCR 扩增ITS 序列及其测定  68-69
  3 结果  69-70
    3.1 PCR 扩增结果  69
    3.2 PCR 产物测序结果  69-70
  4. 讨论  70-71
    4.1 选择ITS 区域进行同源性比对的依据  70
    4.2 兔舍环境中须癣毛癣菌气溶胶的传播  70-71
  5. 结论  71-72
第四部分：荧光定量PCR 检测兔舍环境中气载烟曲霉的含量  72-86
  1. 引言  72-74
    1.1 气载烟曲霉的危害  72
    1.2 检测气载真菌的传统方法  72-73
    1.3 荧光定量PCR  73
    1.4 实验的目的和意义  73-74
  2. 材料和方法  74-82
    2.1 材料  74-76
      2.1.1 动物舍情况  74
      2.1.2 标准菌株  74
      2.1.3 主要实验设备  74
      2.1.4 主要试剂  74-75
      2.1.5 常用实验试剂的配制  75-76
    2.2 方法  76-82
      2.2.1 空气样品的收集  76
      2.2.2 研磨法快速提取液体中真菌DNA 的步骤  76-77
      2.2.3 真菌菌落DNA 的提取  77
      2.2.4 引物设计与合成  77-78
      2.2.5 质粒标准品的构建  78-81
      2.2.6 制作标准曲线  81-82
      2.2.7 样品的检测  82
  3. 结果  82-83
    3.1 外围引物扩增Mt01 基因产物的鉴定  82
    3.2 测序鉴定  82-83
    3.3 标准曲线  83
    3.4 气载烟曲霉的浓度  83
  4. 讨论  83-85
    4.1 荧光定量PCR 方法的优势  83-84
    4.2 两种方法所测结果的比较  84-85
    4.3 荧光定量PCR 检测结果的风险评估  85
  5. 结论  85-86
结论  86-87
参考文献  87-98
附录1 采样仪器及部分采样动物舍情况  98-100
附录2 部分真菌图片  100-103
致谢  103-104
博士在读期间发表学术论文  104

兔舍环境真菌气溶胶及其向环境的传播

内容摘要

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