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奶牛乳房炎病原菌分离鉴定及停乳链球菌荚膜多糖的提纯

作　者: 王正兵
导　师: 贾宁；李宏胜
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 奶牛乳房炎分离鉴定药敏试验荚膜多糖提取和纯化
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

奶牛乳房炎是奶牛的一种常见多发病,也是现在奶牛养殖业中危害最大、造成经济损失最严重的疾病。为查明引起我国奶牛乳房炎的主要病原菌区系分布状况,从我国部分地区规模化奶牛场采集临床型乳房炎奶样201份,采用划线分离法和生化鉴定法进行了奶牛乳房炎主要病原菌的分离鉴定试验。结果表明,从送检的201份奶样中,无菌奶样23份,奶样出菌率为88.6%。其余178份奶样分离到9种共239株细菌,其中,与乳房炎有密切关系的病原菌主要为,无乳链球菌89株(37.23%)、停乳链球菌53株(22.18%)、金黄色葡萄球菌47株(19.67%)和大肠杆菌31株(12.97%)等。试验基本查明了我国奶牛乳房炎主要病原菌的区系分布情况,对奶牛乳房炎的防治具有重要的意义。为了解我国奶牛乳房炎主要病原菌对常见抗生素的耐药情况,以指导临床合理用药。从新分离出和过去保存的奶牛乳房炎主要病因菌中选取不同地区的无乳链球菌、停乳链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌地方菌株各20株,采用K-B药敏纸片法进行了其对常见抗生素的耐药性检测。结果表明,奶牛乳房炎4种主要菌对大部分抗生素均产生了不同程度的耐药性,其耐药率达10%～100%,尤其是对青霉素G、链霉素和复方新诺明产生了较强的耐药性,其耐药率达30%～100%。未发现对4种菌均高度敏感的药物。对4种菌相对均有较强抑制作用的药物主要有氟苯尼考、左氟沙星、洛美沙星、氟哌酸和头孢类药物,其敏感度达60%～100%。试验基本查明了我国奶牛乳房炎主要病原菌的耐药变迁情况,对指导临床合理用药具有重要的意义。为制备高效的奶牛乳房炎链球菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗,对奶牛乳房炎停乳链球菌荚膜多糖的分离纯化工艺进行了研究。进行了培养时间对细菌浓度与荚膜多糖得率影响,发酵液pH值对荚膜多糖的得率影响,去除核酸的乙醇浓度,沉淀多糖所需的乙醇浓度、温度和时间,去除杂蛋白时冷酚抽提的次数等试验。最终建立了以下荚膜多糖分离纯化工艺流程,即停乳链球菌发酵8h收获发酵液,调发酵液pH为7.0,离心收集上清液,过0.22um滤膜除菌,10KD膜包超滤浓缩10倍,25%乙醇沉淀去核酸,离心收集上清液,80%乙醇沉淀获粗多糖,冷酚抽提3次去除杂蛋白,收集糖液层,透析除去残留酚,收集透析内液,然后用80%的乙醇沉淀获得纯化的链球菌荚膜多糖抗原。试验建立的奶牛乳房炎停乳链球菌荚膜多糖抗原的提取纯化工艺成本低,操作简单,荚膜多糖得率高,同时又能保证多糖抗原各项指标均符合2000版《生物制品规程》的要求,具有高度的可行性和有效性。为制备奶牛乳房炎链球菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗奠定了基础。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-9
第一部分综述  9-20
  第一章奶牛乳房炎研究进展  9-16
    1 奶牛乳房炎的病因  9-11
      1.1 生物性因素  9-10
      1.2 环境卫生  10
      1.3 遗传因素  10
      1.4 饲养管理  10
      1.5 其他原因  10-11
    2 奶牛乳房炎的诊断  11-14
      2.1 临床型乳房炎的检查  11
      2.2 隐性型乳房炎的检查  11-14
        2.2.1 乳汁体细胞计数法  11-12
        2.2.2 乳汁pH 值检验法  12
        2.2.3 乳汁导电性检查法  12-13
        2.2.4 乳成分直接检验法  13
        2.2.5 PCR 检验法  13-14
    3 奶牛乳房炎的综合防治  14-16
      3.1 加强饲养管理  14
      3.2 药物治疗  14-15
        3.2.1 抗生素治疗  14-15
        3.2.2 中药治疗  15
      3.3 疫苗预防  15
      3.4 其他方法  15-16
  第二章奶牛乳房炎疫苗研究进展  16-20
    1 金黄色葡萄球菌苗  16-17
    2 大肠杆菌苗  17-18
    3 链球菌苗  18-19
    4 乳房炎多联苗  19
    5 结语  19-20
第二部分试验研究  20-44
  第三章奶牛乳房炎主要病原菌的分离鉴定及药敏试验研究  20-27
    1 试验材料  20
      1.1 仪器设备  20
      1.2 培养基及试剂  20
    2 方法  20-23
      2.1 奶样的采集和处理  20-21
      2.2 主要病原菌的分离  21
      2.3 分离纯化的病原菌的生化鉴定  21-23
      2.4 药敏试验  23
    3 试验结果  23-25
      3.1 乳房炎主要病原菌的分离鉴定结果  23-24
      3.2 药敏试验结果  24-25
    4 讨论  25-27
  第四章奶牛乳房炎停乳链球菌荚膜多糖抗原的提取纯化研究  27-44
    1 材料  28
      1.1 菌株  28
      1.2 培养基和试剂  28
      1.3 仪器设备  28
    2 方法  28-35
      2.1 培养时间对荚膜多糖产量影响的研究  28-31
        2.1.1 菌种的活化  28-29
        2.1.2 摇瓶发酵培养  29
        2.1.3 发酵液中菌浓度和荚膜多糖含量的测定  29-31
          2.1.3.1 发酵液中菌浓度的测定  29
          2.1.3.2 发酵液中多糖浓度的测定  29-31
      2.2 荚膜多糖的提取纯化  31-35
        2.2.1 微生物发酵罐发酵试验  31
        2.2.2 荚膜多糖的粗提  31
        2.2.3 荚膜多糖的纯化  31
        2.2.4 纯化的荚膜多糖抗原各项指标的检测  31-35
          2.2.4.1 唾液酸含量的测定  31-33
          2.2.4.2 蛋白质含量测定  33-34
          2.2.4.3 核酸含量测定  34
          2.2.4.4 纯化的荚膜多糖抗原分子量测定  34-35
          2.2.4.5 纯化的荚膜多糖抗原中蛋白、核酸残留分析  35
    3 结果  35-42
      3.1 发酵液PH 值对荚膜多糖得率的影响  35-36
      3.2 培养时间对菌液浓度和荚膜多糖产量的影响  36-37
      3.3 不同乙醇浓度沉淀核酸的效果  37-38
      3.4 不同乙醇浓度沉淀多糖的效果  38-39
      3.5 乙醇沉淀多糖的温度和时间对荚膜多糖得率的影响  39
      3.6 冷酚抽提次数对荚膜多糖得率和蛋白含量的影响  39-40
      3.7 纯化的荚膜多糖抗原的蛋白、核酸、唾液酸含量测定结果  40
      3.8 纯化的荚膜多糖抗原的紫外扫描结果  40-41
      3.9 纯化的荚膜多糖抗原的Sepharose CL-4B 凝胶过滤层析结果  41-42
    4 讨论  42-44
结论  44-45
参考文献  45-50
致谢  50-51
作者简介  51-52
导师简介  52-53

奶牛乳房炎病原菌分离鉴定及停乳链球菌荚膜多糖的提纯

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