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高等植物长链脂肪醇氧化酶初步研究

作　者: 赵仕兰
导　师: 林志新；罗达
学　校: 上海交通大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 拟南芥百脉根水稻长链脂肪醇氧化酶低温病原菌
分类号: Q946.5
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

一些酵母在以烷烃或长链脂肪酸为碳源进行生长时,首先利用定位在内质网膜上的ω-氧化系统将烷烃或长链脂肪酸氧化形成羧酸或二羧酸,然后进入β-氧化为生物体生长提供碳源及能量。在ω-氧化中,烷烃或脂肪酸的亚甲基端依次由P450单加氧酶、产生过氧化氢的长链脂肪醇氧化酶(Long-chain fatty alcohol oxidase, FAO)及醛脱氢酶氧化分别生成ω-醇、ω-醛及ω-脂肪酸。研究表明,当酵母利用烷烃或长链脂肪酸为碳源时,催化第一步反应的P450单加氧酶是由CYP52基因家族的成员编码的。已经发现多种植物中存在与CYP52同源的基因,且这一类基因大都和植物的抗病抗逆相关。既然在植物中存在类似于酵母中催化ω-氧化第一步的酶,那么在植物中是否存在类似的FAO?其功能又是什么?本研究主要对拟南芥、百脉根及水稻这三种高等植物中的FAO基因进行了基因序列分析、生化功能及生理功能等方面的初步研究。首先利用酵母FAO的氨基酸序列对拟南芥全基因组序列进行搜索,发现四个与FAO同源性较高的基因,分别是AtFAO1(At1g03990)、AtFAO3(At3g23410)、AtFAO4a(At4g19380)和AtFAO4b(At4g28570)。通过RT-PCR方法获得了AtFAO1 (At1g03990), AtFAO4a (At4g19380)和AtFAO4b (At4g28570)三个基因的全长ORF。接着利用拟南芥的四个FAO全长氨基酸序列搜索百脉根的EST数据库,得到一个EST序列。根据该序列设计引物并以百脉根顶端cDNA为模板进行3’-RACE,得到一个1.4 kb的片段。以该片段为探针筛选百脉根cDNA文库并最终得到了LjFAO1基因。利用PCR方法得到全长为3.6 kb的LjFAO1基因基因组DNA。另外还通过cDNA文库筛选得到了百脉根中的LjFAO2。再利用拟南芥中FAO的氨基酸序列对水稻基因组进行tblastn及blastp搜索。结果显示在水稻基因组中存在四个FAO基因,一个位于2号染色体,命名为OsFAO1;另外三个在10号染色体上,分别命名为OsFAO2、OsFAO3和OsFAO4。对上述的10个FAO基因做序列分析发现:存在于高等植物中的FAO基因大多为三个外显子和两个内含子的基因结构;其氨基酸序列都具有酵母FAO蛋白的五个保守结构域。进化分析表明FAO在单双子叶植物中的分化是在单双子叶植物分化之后。将得到的基因序列用原核表达系统进行蛋白表达后检测酶活,结果只有AtFAO4b和LjFAO1两个蛋白能够催化长链脂肪醇的氧化。酶动力学分析表明,AtFAO4b和LjFAO1都具有底物特异性。利用Ni-NTA柱纯化这两个蛋白后进行电泳检测,结果都得到了单一的蛋白条带。对AtFAO3和AtFAO4b的表达模式进行了RT-PCR检测。结果显示:AtFAO3和AtFAO4b基因在整株中均有表达,但是其表达水平在不同组织部位存在差异;AtFAO3和AtFAO4b对低温胁迫响应不同。对AtFAO3和AtFAO4b的T-DNA插入突变体进行病原菌接种,发现病原菌感染对AtFAO3的T-DNA插入突变体生长没有影响,而AtFAO4b的T-DNA插入突变体表现出易感性增高。这些结果说明AtFAO3和AtFAO4b虽然都能够催化长链脂肪醇氧化,但是它们在植物体内的功能不相同。AtFAO4b可能在拟南芥脂肪代谢及细胞壁发育中具有重要的作用。RT-PCR分析显示LjFAO1在整株中都有表达,但是在顶端表达水平最高而在果荚中表达量最低。在8日龄的百脉根幼苗的顶端和子叶中,LjFAO1表达水平可被低温诱导下调。对公共数据库中水稻FAO基因的表达模式数据进行分析发现OsFAO1和OsFAO4的表达水平较高,OsFAO2和OsFAO3的表达水平较低,而且四个基因对逆境处理有不同的响应。上述结果说明,在高等植物中普遍存在FAO基因,拟南芥、百脉根与水稻的研究表明该类基因可能与植物的抗病抗逆相关。

全文目录

摘要  5-8
ABSTRACT  8-11
目录  11-14
缩写列表  14-15
第一章. 酵母和植物中ω-氧化研究进展  15-40
  1.1 酵母中的ω-氧化研究进展  15-32
    1.1.1 酵母CYP52 的特性与功能  16-24
    1.1.2 酵母长链脂肪醇氧化酶研究进展  24-31
    1.1.3 酵母脂肪醛脱氢酶研究进展  31-32
  1.2 植物中的长链脂肪酸ω-氧化研究进展  32-39
    1.2.1 植物中CYP52 同源基因的研究进展  33-37
    1.2.2 植物中的长链脂肪醇氧化酶基因研究进展  37-39
  1.3 本文的目的与意义  39-40
第二章. 材料和方法  40-53
  2.1 实验材料  40-43
    2.1.1 植物材料  40
    2.1.2 大肠杆菌菌株  40
    2.1.3 常用载体  40
    2.1.4 cDNA 文库  40-41
    2.1.5 常用耗材  41
    2.1.6 引物序列  41-43
    2.1.7 序列分析软件  43
  2.2 实验方法  43-53
    2.2.1 植物材料的培养  43-44
    2.2.2 植物基因组DNA 的提取  44-45
    2.2.3 植物总DNA 的制备  45-46
    2.2.4 PCR 反应  46-47
    2.2.5 PCR 产物克隆及鉴定  47
    2.2.6 基因组Southern blotting  47-48
    2.2.7 cDNA 文库的筛选  48-49
    2.2.8 蛋白的制备  49-50
    2.2.9 酶活性检测（1ml 体系）  50-51
    2.2.10 植株的逆境处理  51
    2.2.11 拟南芥遗传转化及筛选  51-53
第三章. 高等植物长链脂肪醇氧化酶基因的克隆及序列分析  53-80
  3.1 前言  53-55
  3.2 实验结果  55-77
    3.2.1 高等植物长链脂肪醇氧化酶基因的克隆  55-65
    3.2.2 高等植物长链脂肪醇氧化酶基因序列分析  65-72
    3.2.3 Southern Blotting 检测百脉根LjFAO 拷贝数  72-74
    3.2.4 高等植物长链脂肪醇氧化酶的进化分析  74-77
  3.3 讨论  77-79
    3.3.1 LjFAO 基因的拷贝数检测及序列分析  77
    3.3.2 水稻中FAO 基因结构的预测  77-78
    3.3.3 水稻FAO 基因的克隆  78-79
  3.4 本章小结  79-80
第四章. 高等植物长链脂肪醇氧化酶的生物化学功能研究  80-97
  4.1 前言  80-81
  4.2 实验结果  81-90
    4.2.1 AtFAO4b 蛋白的原核表达及纯化  81-83
    4.2.2 AtFAO4b 蛋白的酶活测定  83-85
    4.2.3 LjFAO1 蛋白的原核表达与纯化  85-87
    4.2.4 LjFAO1 蛋白的酶活测定  87-88
    4.2.5 截短及点突变LjFAO1 蛋白研究  88-90
  4.3 讨论  90-96
    4.3.1 保守结构域对LjFAO1 蛋白酶活性的影响  90
    4.3.2 底物浓度对酶活性检测的影响  90-91
    4.3.3 水稻FAO 基因的原核表达  91-96
  4.4 本章小结  96-97
第五章. 高等植物长链脂肪醇氧化酶生理功能研究  97-119
  5.1 前言  97-98
  5.2 实验结果  98-116
    5.2.1 AtFAO3 和AtFAO4b 的启动子元件分析  98-99
    5.2.2 AtFAO3 和AtFAO4b 的芯片数据分析  99-101
    5.2.3 AtFAO3 和AtFAO4b 的表达  101-102
    5.2.4 AtFAO3 和AtFAO4b 对冷害处理的响应  102-103
    5.2.5 AtFAO3 和AtFAO4b 的T-DNA 插入突变体鉴定  103-107
    5.2.6 AtFAO3 和AtFAO4b 的T-DNA 插入突变体的表型  107-110
    5.2.7 RT-PCR 确定LjFAO1 基因的表达模式  110-111
    5.2.8 LjFAO1 对逆境的响应  111-112
    5.2.9 水稻FAO 基因的表达模式  112-114
    5.2.10 水稻FAO 基因对逆境的响应  114-115
    5.2.11 水稻FAO 基因的T-DNA 插入突变株系  115-116
  5.3 讨论  116-118
    5.3.1 AtFAO 突变体的表型  116-117
    5.3.2 AtFAO3 和AtFAO4b 的功能差异  117
    5.3.3 低温对 LjFAO1 基因表达水平的影响  117-118
  5.4 本章小结  118-119
第六章. 全文总结  119-122
  6.1 主要结论  119-120
  6.2 研究展望  120-122
参考文献  122-130
附录一文中部分基因序列  130-136
附录二载体图谱  136-137
在读期间发表论文  137-138
致谢  138

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