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骨髓间充质干细胞移植对烟雾吸入性损伤炎症反应及组织修复的影响

作　者: 朱峰
导　师: 郭光华
学　校: 南昌大学
专　业: 外科学
关键词: 骨髓间充质干细胞兔全骨髓培养法细胞培养流式细胞术 5-溴脱氧尿嘧啶核苷烟雾吸入性损伤模型移植肺损伤炎症反应血管外肺水组织修复分化
分类号: R363
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的：探讨分离、体外培养、鉴定及体外标记兔骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, MSCs)的方法,为进一步的实验研究打下基础。方法：选择健康幼龄新西兰大耳白兔,于双侧髂后上嵴及胫骨上端内侧部行骨髓穿刺提取骨髓。采用全骨髓培养法(直接贴壁法)分离培养MSCs,对第2、3、4、5、6代MSCs应用MTT法测定生长曲线,分析MSCs的生长规律。对MSCs进行形态学观察,通过流式细胞术对CD34、CD44、CD45、CD105四种MSCs表面抗原进行鉴定,证明所培养的细胞为MSCs。采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyuridine, BrdU)体外标记兔MSCs,检测不同标记时间和标记浓度的标记阳性率。结果：全骨髓培养法培养的原代MSCs接种4天后可以被观察到,形态均匀成梭形,生长增殖迅速,符合MSCs生长的特性,7-8天MSCs融合接近80%,传代培养生长良好。MSCs生长曲线呈S型,由生长曲线分析可知,MSCs在培养第4-8天为高速生长期,MSCs在第3-5代生长最为旺盛。经流式细胞术鉴定,CD34 (-)、CD45 (-)、CD44 (+)、CD105(+),证明所培养的细胞为较纯的MSCs。BrdU体外标记兔MSCs的阳性率达到85-90%,40μmol/L、标记72h为最佳标记浓度和标记时间。结论：应用本实验方法,可以分离、纯化培养兔骨髓间充质干细胞且操作简便,效率高,经济实用。所培养的MSCs体外生长稳定、增殖速度快、贴壁率高、可连续传代,可用于MSCs功能及应用的进一步研究。应用BrdU体外标记兔MSCs是安全可靠的。目的：建立兔烟雾吸入性损伤模型。方法：采用自制烟雾吸入性损伤致伤仪致伤。以干燥的松木屑及煤油为发烟材料,在密闭环境使兔自行吸入烟雾10min,间隔2min再次致伤10min。伤后观察兔临床表现、各时点血气及伤后24h肺组织切片观察。结果：(1)伤后兔呼吸频率明显加快,呼吸困难明显,肺部可及干啰音,24h后呼吸症状改善。(2)血气示PaO2由伤前90.20±18.44mmHg分别降至伤后10min 63.48±12.90mmHg、伤后2h 56.96±10.23mmHg及伤后4h 65.76±12.55mmHg,与伤前比较差异有显著性(P<0.05)。至伤后24h基本恢复正常；PaCO2由伤前32.10±5.48mmHg分别升至伤后10min 41.72±6.33mmHg、伤后2h 43.12±5.42mmHg及伤后4h 39.11±6.91mmHg与伤前比较差异有显著性(P<0.05)。至伤后24h基本恢复正常。(3)组织病理学观察：大体观见伤肺苍白,包膜紧张,大片出血灶；光镜下见血管内充血、肺泡水肿和出血、间质水肿及炎性细胞浸润等肺损伤改变。结论：本文推荐的兔烟雾吸入性损伤模型是一种简便、实用、稳定、经济、重复性好的烟雾吸入性损伤模型,适于烟雾吸入性损伤的研究。目的：探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, MSCs)移植对烟雾吸入性损伤兔炎症反应的影响,评价MSCs移植的治疗效果,初步揭示MSCs移植对烟雾吸入性损伤影响的可能机制。方法：64健康新西兰大耳白兔随机数字表法分为2组：烟雾吸入性损伤组(S组)和MSCs治疗组(M组),每组各32只动物。另取8只动物做正常对照组测基础值。正常对照组不致伤,仅经耳缘静脉注入10ml PBS液；S组致伤后立即经耳缘静脉注入10ml PBS液；M组致伤后立即经耳缘静脉注入内含1×107个第三代兔MSCs的PBS液10ml。S组和M组伤后分为2h、4h、6h、24h观察,每个时间点8只动物,主要观察指标和方法：①采用ELISA法检测正常对照值、S组和M组伤后2h、4h、6h外周血以及肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)含量并作比较。②采用RT-PCR法检测S组和M组伤后2h、4h、6h肺组织TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 mRNA的表达并作比较。③检测正常对照组、S组和M组伤后6h和24h肺水质量分数并作比较。④大体和光镜下分别观察正常对照组、S组和M组伤后2h、4h、6h、24h肺组织和支气管组织的变化。结果：(1)促炎因子：实验开始后2h、4h、6h,M组外周血和肺组织中主要促炎因子IL-1β、IL-6以及TNF-α含量与相应S组对应时间点值相比均显著降低(P<0.05)。S组外周血和肺组织中主要促炎因子IL-1β、IL-6以及TNF-α含量与相应组内正常对照值相比均显著升高(P<0.05)。M组外周血和肺组织中IL-1β含量与组内正常对照值相比无显著差异(P>0.05),M组外周血和肺组织中TNF-α含量与组内正常对照值相比显著升高(P<0.05),与组内正常对照值相比,肺组织中IL-6含量显著升高(P<0.05)而外周血IL-6含量无显著差异(P>0.05)。(2)抗炎因子：实验开始后2h、4h、6h,M组外周血主要抗炎因子IL-10含量与相应S组对应时间点值相比均显著升高(P<0.05),M组和S组2h、4h、6h含量较各自正常对照值均显著升高(P<0.05)；M组肺组织中IL-10含量与相应S组对应时间点值相比,4h和6h显著升高(P<0.05)而2h升高不显著(P>0.05)。组内比较,S组2h、4h、6h IL-10含量较正常对照值差异不显著(P>0.05),M组4h和6h显著升高(P<0.05)而2h升高不显著(P>0.05)。(3)VEGF水平：S组和M组外周血与肺组织中VEGF水平伤后2h、4h、6h迅速升高,与正常对照值比较均显著升高(P<0.05)。M组外周血伤后各时间点VEGF水平与S组对应时间点相比,VEGF值却显著下降(P<0.05)；而M组肺组织伤后各时间点VEGF水平与S组对应时间点相比VEGF值却显著升高(P<0.05)。(4)主要炎症因子的mRNA表达：TNF-α,IL-1β、IL-6 mRNA相对表达量在M组4h和6h显著低于S组相应时间点TNF-α,IL-1β、IL-6 mRNA相对表达量(P<0.05),仅M组2h IL-6 mRNA相对表达量与相应时间点比较无显著差异(P>0.05)；M组各时间点IL-10 mRNA相对表达量均显著高于S组相应时间点IL-10 mRNA相对表达量(P<0.05)。(5)处置后6h和24h,M组实验结束后肺水质量分数较S组均显著降低(P<0.05)。S组和M组6h和24h与正常对照值比较均显著升高(P<0.05)。(6)病理学观察：大体观察：从色泽、包膜紧张度、光滑度、充血状况、出血坏死灶大小、分泌物等指标综合观察,M组各时间点较S组改善明显,正常对照组和U组未见异常。组织病理学观察：从上皮脱落、充血、出血、渗出、肺泡隔情况、肺水肿、肺不张、肺气肿、炎症细胞浸润、成纤维细胞增生等指标综合观察,M组各时间点支气管和肺组织较S组改善明显,正常对照组结构正常。结论：MSCs静脉移植至烟雾吸入性损伤兔体内,能显著降低其全身和局部主要促炎因子水平,升高其全身和局部抗炎因子水平,减少其血管外肺水,改善肺和气管组织损伤程度,对烟雾吸入性损伤具有抗炎保护作用。抗炎-免疫调节作用是MSCs移植对烟雾吸入性损伤治疗作用的另一主要机制。目的：探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, MSCs)移植对烟雾吸入性损伤兔组织修复的影响。方法：32健康新西兰大耳白兔随机数字表法分为4组：正常对照组(C组)、正常对照+MSCs治疗组(U组)、烟雾吸入性损伤组(S组)和MSCs治疗组(M组),每组8只实验动物。C组不致伤,仅经耳缘静脉注入10ml PBS液；U组也不致伤,仅经耳缘静脉注入内含1×107个BrdU标记的第三代兔MSCs的PBS液10ml；S组致伤后立即经耳缘静脉注入10ml PBS液；M组致伤后立即经耳缘静脉注入内含1×107个BrdU标记的第三代兔MSCs的PBS液10ml。4组分为7d和28d两个时间点观察,每个观察点4只动物,主要观察指标和方法：①大体和光镜下分别观察4组伤后7d和28d肺组织和支气管组织的变化。②采用免疫组化技术观察4组处置后7dMSCs体内“归巢”情况；采用免疫组化双染色技术观察4组处置后28dMSCs体内分化情况。结果：①大体观察：从色泽、包膜紧张度、光滑度、充血状况、出血坏死灶大小、分泌物等指标综合观察,M组7d和28d较S组改善明显,C组和U组未见异常。组织病理学观察：从上皮脱落、充血、出血、渗出、肺泡隔情况、肺水肿、肺不张、肺气肿、炎症细胞浸润、成纤维细胞增生等指标综合观察,M组7d和28d支气管和肺组织较S组改善明显,C组和U组结构正常。②免疫组织化学染色显示M组BrdU标记的MSCs伤后7天能在支气管组织和肺组织中大量“归巢”,而C组、S组及U组未见或者极少见“归巢”。③免疫组化双染色显示M组可见水通道蛋白-5(AQP-5)和BrdU双染阳性细胞,说明MSCs在肺内能分化为肺泡Ⅰ型上皮细胞；可见碱性磷酸酶(AKP)和BrdU双染阳性细胞,说明MSCs在肺内能分化为肺泡Ⅱ型上皮细胞；可见CD34和BrdU双染阳性细胞,说明MSCs在肺内能分化为肺血管内皮细胞。C组、U组、S组均未见上述双染色阳性细胞。结论：经静脉移植至烟雾吸入性损伤兔体内的MSCs均能“归巢”至损伤和炎症反应明显的肺组织和支气管组织区域并分化为肺泡Ⅰ型上皮细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞以及肺血管内皮细胞,减轻肺组织损伤,可能参与并加快了烟雾吸入性损伤的组织修复过程。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-20
第1章引言  20-23
第2章兔骨髓间充质干细胞的分离、体外培养、鉴定和体外标记  23-38
  2.1 概述  23
  2.2 材料与方法  23-27
  2.3 结果  27-34
  2.4 讨论  34-37
  2.5 结论  37-38
第3章兔烟雾吸入性损伤模型的建立  38-49
  3.1 概述  38
  3.2 材料与方法  38-42
  3.3 结果  42-46
  3.4 讨论  46-47
  3.5 结论  47-49
第4章骨髓间充质干细胞移植对烟雾吸入性损伤兔炎症反应的影响  49-80
  4.1 概述  49
  4.2 材料与方法  49-57
  4.3 结果  57-75
  4.4 讨论  75-79
  4.5 结论  79-80
第5章骨髓间充质干细胞移植对烟雾吸入性损伤兔组织修复的影响  80-101
  5.1 概述  80
  5.2 材料与方法  80-85
  5.3 结果  85-95
  5.4 讨论  95-100
  5.5 结论  100-101
第6章全文总结与展望  101-103
  6.1 全文总结  101
  6.2 展望  101-103
致谢  103-105
参考文献  105-112
攻读学位期间的研究成果  112-114
综述  114-127

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