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鸡硒蛋白W基因克隆表达及单克隆抗体制备与鉴定

作　者: 徐铭
导　师: 徐世文
学　校: 东北农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 鸡硒蛋白W 单克隆抗体原核表达间接ELISA
分类号: S831
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

硒是人和动物生命活动必需的一种重要的微量元素。硒蛋白是硒共价结合在蛋白质中形成硒代半胱氨酸形式。硒蛋白W(SelW)是一种低分子量的细胞内硒蛋白。在不同的生物中,SelW的氨基酸序列高度同源。已有的研究表明SelW在多种组织器官均有表达,且以骨骼肌和脑表达量较高。目前对哺乳动物和啮齿类SelW功能的研究表明,SelW具有调节横纹肌代谢、钙代谢和抗氧化等作用。但是,对于鸡SelW的功能却未见报道。为深入研究鸡硒蛋白W的功能,我们根据鸡SelW的cDNA序列设计引物,对含完整ORF的cDNA序列进行扩增,利用重叠延伸PCR技术对cDNA中的Sec密码子进行突变,经序列分析,结果与参考序列同源性达99%以上,并将突变产物克隆进pGEX-6P-1表达载体,构建重组表达质粒pGEX-SelW,转化到Rosetta宿主菌,经IPTG诱导,实现了重组融合蛋白的高效表达,且均主要以包涵体形式表达,通过切胶的方法纯化重组融合蛋白,再利用凝血酶切掉GST标签,经第二次切胶纯化得到目的蛋白。多克隆抗体经Western blotting表明与相应的GST-SelW融合蛋白反应能产生特异性条带,而与空载体诱导后的GST标签蛋白不反应。纯化蛋白免疫BABL/c小鼠,利用细胞融合技术,经间接ELISA筛选和4次细胞亚克隆,获得2株杂交瘤细胞,分别命名为1B8和4H5。经单克隆抗体亚类试剂盒鉴定,均为IgM类抗体上清滴度分别为1:6400。制备了1B8和4H5腹水单抗,腹水滴度分别为1:12800和1:6400。2株杂交瘤细胞染色体数为103±5,明显多于SP2/0骨髓瘤细胞65~75条。2株杂交瘤细胞在体外连续传代3个月和冻存后再复苏均不影响抗体分泌的稳定性。与GST标签和鸡硒蛋白N均无交叉反应。亲和力分析表明,2株单抗对目的蛋白的亲和力高于重组融合蛋白和鸡SelW合成多肽,且亲和力较高,这些为单抗敏感、稳定和快捷的检测应用提供了必要的保证。总之,2株单抗的成功制备为鸡SelW的快速、特异性检测提供了检测试剂,同时也为鸡SelW功能进一步研究提供物质基础。

全文目录

中文摘要  10-11
英文摘要  11-13
1. 引言  13-20
  1.1 硒的发现与研究  13
  1.2 硒蛋白的合成及调控  13-14
  1.3 硒蛋白W  14-18
    1.3.1 SelW 的组织分布  15
    1.3.2 SelW 的基因结构  15-16
    1.3.3 SelW 的氨基酸序列  16
    1.3.4 SelW 蛋白结构  16-17
    1.3.5 食物硒对SelW mRNA 的调控  17
    1.3.6 SelW 的功能  17-18
  1.4 杂交瘤单克隆抗体技术  18-19
  1.5 实验的目的意义  19-20
2. 试验方法与材料  20-39
  2.1 试验试剂与材料  20-23
    2.1.1 试验试剂  20
    2.1.2 菌种与载体  20
    2.1.3 实验材料  20
    2.1.4 实验动物  20
    2.1.5 主要试剂的配制  20-23
    2.1.6 仪器设备  23
  2.2 实验方法  23-31
    2.2.1 目的基因原核表达载体构建  23-27
    2.2.2 鸡SelW cDNA 原核表达载体构建  27-30
    2.2.3 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达  30-31
  2.3 单克隆抗体的制备  31-36
    2.3.1 抗原乳剂的制备  31-32
    2.3.2 动物免疫  32
    2.3.3 间接ELISA 检测方法的建立  32-33
    2.3.4 多克隆抗体的特异性鉴定  33-34
    2.3.5 饲养层细胞的制备  34
    2.3.6 骨髓瘤细胞的准备  34-35
    2.3.7 脾淋巴细胞的准备  35
    2.3.8 细胞融合  35-36
    2.3.9 阳性杂交瘤细胞的筛选  36
    2.3.10 阳性杂交瘤细胞的克隆化—有限稀释法  36
  2.4 单克隆抗体的大量制备  36-37
    2.4.1 体外培养法  36
    2.4.2 体内诱生腹水法  36-37
  2.5 单克隆抗体的部分特性鉴定  37-39
    2.5.1 单克隆抗体上清及腹水效价测定  37
    2.5.2 阳性杂交瘤细胞的冻存和复苏  37
    2.5.3 单克隆抗体亚类鉴定  37
    2.5.4 杂交瘤细胞染色体数鉴定  37-38
    2.5.5 单克隆抗体分泌抗体稳定性鉴定  38
    2.5.6 单克隆抗体的特异性分析  38
    2.5.7 单克隆抗体亲和度测定  38-39
3. 试验结果与分析  39-52
  3.1 突变型鸡Sel W cDNA 的制备  39-41
    3.1.1 重叠延伸PCR  39-40
    3.1.2 突变型鸡SelW cDNA 基因的克隆、鉴定及序列测定与分析  40-41
  3.2 鸡Sel W cDNA 原核表达载体构建  41-43
    3.2.1 纯化PCR 扩增产物和载体pGEX-6P-1 双酶切  41
    3.2.2 重组质粒的鉴定  41-43
  3.3 重组蛋白的表达与鉴定  43-44
    3.3.1 重组融合蛋白的诱导表达  43
    3.3.2 表达条件的常规优化  43
    3.3.3 重组蛋白的可溶性分析  43-44
  3.4 凝血酶切除GST 标签并纯化目的蛋白  44-45
  3.5 纯化后目的蛋白浓度  45
  3.6 间接ELISA 反应条件的优化  45-47
    3.6.1 抗原与血清工作浓度的确定  45
    3.6.2 酶标抗体工作浓度的确定  45-46
    3.6.3 血清作用时间的确定  46
    3.6.4 酶标抗体作用时间的确定  46
    3.6.5 封闭液与其封闭时间的确定  46-47
    3.6.6 底物显色时间的确定  47
  3.7 多克隆抗体的特异性鉴定  47-48
  3.8 杂交瘤细胞系的建立及部分特性鉴定结果  48-52
    3.8.1 细胞融合率  48
    3.8.2 单克隆抗体效价测定  48
    3.8.3 杂交瘤细胞株分泌抗体的稳定性检测结果  48-49
    3.8.4 单克隆抗体亚类鉴定结果  49
    3.8.5 单克隆抗体染色体计数结果  49-50
    3.8.6 单克隆抗体的特异性分析  50
    3.8.7 单克隆抗体亲和度测定  50-52
4. 讨论  52-62
  4.1 目的基因的克隆  52
  4.2 表达载体的选择  52-53
  4.3 宿主表达菌的选择  53
  4.4 表达条件的常规优化  53-54
  4.5 目的蛋白的表达纯化  54
  4.6 间接ELISA 反应条件的优化  54-56
  4.7 抗原制备  56
  4.8 实验动物的挑选和免疫  56-57
  4.9 细胞融合  57-58
  4.10 单克隆细胞株筛选  58
  4.11 杂交瘤细胞的克隆  58-59
  4.12 污染的预防和排除  59-60
  4.13 单克隆抗体的生物学特性  60-62
    4.13.1 单克隆抗体效价  60
    4.13.2 细胞的冻存与复苏  60
    4.13.3 单克隆抗体大量制备方法的选择  60
    4.13.4 单克隆抗体特异性分析  60-61
    4.13.5 单克隆抗体亲和度的测定  61-62
5. 结论  62-63
致谢  63-64
参考文献  64-69
攻读硕士学位期间发表的学术论文  69

鸡硒蛋白W基因克隆表达及单克隆抗体制备与鉴定

内容摘要

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