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转基因抗草甘膦棉花种质系的创造及利用

作　者: 燕树锋
导　师: 祝水金
学　校: 浙江大学
专　业: 作物学
关键词: 棉花 草甘膦 遗传转化 EPSPS 农杆菌 花粉管通道法 遗传分析 农艺性状 纤维品质
分类号: S562
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


杂草是棉花生产主要障碍之一,棉花杂草为害常年造成损失为14%-16%。人工除草是我国控制草害的传统方法。随着城市化进程的加速,农村人口的转移以及劳动力成本的提高,棉田大面积人工除草已不能适应现代农业生产的需求。草甘膦是一种灭生性除草剂,具有广谱、高效、低毒和无残留的特点,其销售额占整个除草剂市场总量的30%,已连续多年占据世界农药销售额首位。抗草甘膦棉花品种是实现田间化学除草的先决条件,培育具有我国自主知识产权的抗草甘膦棉花品种则对于我国棉花产业具有重要的实践意义。本试验以珂字棉201和中棉所49为受体材料,分别通过农杆菌介导法和花粉管通道法两种方法,转化由本校自主研发并具有自主知识产权的抗草甘膦基因EPSPs-G6,创造抗草甘膦的转基因棉花种质资源,为培育具有我国自主知识产权的抗草甘膦转基因棉花品种提供新的种质。同时,对育成的转基因抗草甘膦棉花种质材料进行综合鉴定和评价,为该种质育种利用和抗草甘膦棉花的商业化生产提供科学依据。主要研究结果如下：1.转基因抗草甘膦棉花种质的创造本研究以珂字棉201下胚轴作为外植体,用50 mg.L-1卡那霉素作为抗性愈伤组织的筛选剂,将含有玉米泛素Ubi启动子驱动的EPSPS-G6基因通过农杆菌介导法导入棉花基因组,获得了2株T0代转基因植株,2株转基因植株开花正常,自交种子种成株行(T1)。经过PCR检测证实EPSPS-G6基因已经导入棉花基因组,但对草甘膦的抗性较差,可能与来源于单子叶玉米的Ubi启动子在棉花中驱动EPSPS-G6基因表达效率有关。通过花粉管通道法将Camv 35S启动子驱动的EPSPS-G6基因导入陆地棉品种中棉所49,共获得26个具有草甘膦抗性的转化植株。PCR检测、Southem点杂交、Southem杂交(双酶切和单酶切)均证实EPSPS-G6基因已经导入棉花基因组。T1田间抗性鉴定结果表明26个转化子中20个转化子经卡方测定符合一对基因的分离规律。经T2田间抗性鉴定,共获得152个纯合材料,分别来源于26个转化子。2.田问抗性鉴定各试验材料分别用15 mM、20 mM、30 mM和40 mM浓度的草甘膦进行涂抹鉴定。非转基因的中棉所49和TM-1对草甘膦十分敏感,15 mM浓度草甘膦处理下死亡。本研究获得的不同转基因材料对草甘膦抗性存在着显著差异,其中采用花粉通管法获得的26个转化子在20 mM田间使用草甘膦浓度下均无反应,但在30 mM草甘膦浓度下,EHC09-045和EHC09-029发生萎蔫或轻萎蔫,但都得到恢复。在40 mM草甘膦浓度下,有11个转化子的幼苗仍无反应,表现为高抗草甘膦；13个转化子发生轻萎蔫或萎蔫,但恢复,表现为中度抗草甘膦；2个转化子死亡,抗草甘膦性较弱。3.抗草甘膦性状的遗传分析选用5个转基因抗草甘膦棉花种质系(EHC09-002、EHC09-009、EHC09-036、EHC09-038和EHC09-045)进行遗传分析,结果表明5个转基因抗草甘膦棉花种质系均不受细胞质效应的影响,EHC09-002,EHC09-009和EHC09-036三个转化子与TM-1和中棉所49正反交F2,经χ2检验符合3：1的分离规律,分子检测表明这三个转化子都是单基因插入的,与遗传研究相符。但EHC09-038和EHC09-045两个转化子经χ2检验不符合3：1的分离规律,这可能与基因的插入位点和基因的整合有关。4.转基因抗草甘膦棉花种质系的农艺性状和纤维品质本研究中通过花粉管通道法获得的26个转化子,农艺性状和纤维品质总体表现较好,部分转化子表现优于对照。T,农艺性状考察结果表明转基因抗草甘膦棉花株高、果枝数和单株铃数三项指标与对照相比差异不大,但外源基因的导入对转基因抗草甘膦棉花的衣分影响较大。T2农艺性状和纤维品质考察结果表明外源基因的导入对纤维长度和整齐度影响不大,而对麦克隆值、伸长率和断裂比强度等纤维品质指标,以及铃重和衣分等农艺性状均有较大影响。因此,转基因棉花育种研究中不仅只注重目标性状的转育,还要注重非目标性状的筛选。5.市售草甘膦对转基因抗草甘膦棉花幼苗生长的影响以转基因抗草甘膦棉花种质系EHC09-008和EHC09-020及其非转基因遗传背景亲本对照中棉所49为材料,研究了市售10%草甘膦水剂和95%的草甘膦粉剂对抗草甘膦棉花种子萌发和幼苗生长的影响。研究结果表明,10%的草甘膦水剂中可能含有其他除草剂或对棉花幼苗生长发育有害的物质,影响抗草甘膦棉种子的萌发和幼苗的生长。因此,在转基因抗草甘膦棉花生产应用时,应必谨慎选用草甘膦除草剂产品。

全文目录


致谢  5-6
前言  6-8
摘要  8-11
Abstract  11-14
缩略词表  14-15
目录  15-18
第一章 文献综述  18-45
  1.1 棉田杂草的分布情况和控制措施  18-21
    1.1.1 我国棉田杂草的分布情况  18-20
    1.1.2 棉田杂草的控制措施  20-21
  1.2 除草剂的种类和特点  21-23
    1.2.1 除草剂的发展历史  21
    1.2.2 除草剂的种类及其作用靶标  21-23
  1.3 草甘膦除草剂  23-31
    1.3.1 草甘膦除草机理  25-27
    1.3.2 草甘膦的靶标酶  27-29
    1.3.3 生物抗草甘膦的机理  29-31
  1.4 棉花抗除草剂基因工程进展  31-43
    1.4.1 抗除草剂基因的克隆  32-33
    1.4.2 棉花外源基因转化方法  33-41
      1.4.2.1 农杆菌介导法  34-37
      1.4.2.2 基因枪法  37-39
        1.4.2.2.1 基因枪法原理和优缺点  37-38
        1.4.2.2.2 基因枪法在棉花基因工程中的应用  38-39
      1.4.2.3 花粉管通道法  39-41
        1.4.2.3.1 花粉管通道法原理和优缺点  39-40
        1.4.2.3.2 棉花花粉管通道法的应用  40-41
    1.4.3 抗除草剂棉花基因工程  41-43
      1.4.3.1 抗2,4-D棉花  41
      1.4.3.2 抗溴苯腈棉花  41
      1.4.3.3 抗草铵膦棉花  41-42
      1.4.3.4 抗磺酰脲类棉花  42
      1.4.3.5 抗草甘膦棉花  42-43
  1.5 本研究的选题依据、内容及目的意义  43-45
第二章 转基因抗草甘膦棉花种质系的创造  45-63
  2.1 材料与方法  46-51
    2.1.1 试验材料和试剂  46-49
      2.1.1.1 受体棉花品种  46
      2.1.1.2 菌株和质粒载体  46-47
      2.1.1.3 培养基和所需溶液配制  47-49
        2.1.1.3.1 细菌培养基  47
        2.1.1.3.2 植物培养基  47-48
        2.1.1.3.3 质粒DNA的大量提取所需溶液配制  48-49
    2.1.2 试验方法  49-51
      2.1.2.1 大肠杆菌质粒DNA的大量提取  49
      2.1.2.2 基因转化方法  49-50
        2.1.2.2.1 农杆菌介导法  49-50
        2.1.2.2.2 花粉管通道法  50
      2.1.2.3 转基因植株农艺性状调查和测定  50-51
  2.2 结果与分析  51-59
    2.2.1 农杆菌介导法获得转基因抗草甘膦棉花  51-52
    2.2.2 花粉管通道法获得转基因抗草甘膦棉花  52-59
      2.2.2.1 注射浓度对于注射转化率的影响  52-53
      2.2.2.2 田间草甘膦筛选浓度的确定  53-54
      2.2.2.3 转基因抗草甘膦棉花的田间鉴定  54-57
      2.2.2.4 转基因抗草甘膦棉花种质系的农艺性状和纤维品质  57-59
  2.3 讨论  59-63
第三章 转基因抗草甘膦棉花种质系的分子检测与遗传研究  63-84
  3.1 材料与方法  63-72
    3.1.1 试验材料和和所需溶液配制  63-66
      3.1.1.1 棉花材料  63-64
      3.1.1.2 相关试剂  64
      3.1.1.3 棉花基因组DNA提取所需溶液的配置  64-65
      3.1.1.4 Southern杂交所需溶液配制  65-66
        3.1.1.4.1 室温稳定溶液  65-66
        3.1.1.4.2 现配现用溶液  66
    3.1.2 试验方法  66-72
      3.1.2.1 草甘膦田间抗性鉴定  66
      3.1.2.2 转基因棉花的分子检测  66-71
        3.1.2.2.1 棉花基因组DNA提取方法(CTAB法)  66-67
        3.1.2.2.2 转化棉株的PCR检测  67
        3.1.2.2.3 转化棉株的Southern杂交  67-71
        3.1.2.2.4 转化棉株的Southern点杂交  71
      3.1.2.3 抗草甘膦性的遗传分析  71-72
  3.2 结果与分析  72-81
    3.2.1 转基因棉株种质材料的田间抗性鉴定  72-73
    3.2.2 转基因棉株的分子检测  73-78
      3.2.2.1 转基因棉株的DNA提取  73-74
      3.2.2.2 转基因棉株的PCR检测  74-75
      3.2.2.3 转基因棉株的Southern杂交分析  75-78
    3.2.3 抗草甘膦性状的遗传分析  78-81
  3.3 讨论  81-84
第四章 市售草甘膦对转基因抗草甘膦棉花幼苗生长的影响  84-98
  4.1 材料和方法  84-86
    4.1.1 试验材料  84-85
      4.1.1.1 供试材料  84
      4.1.1.2 草甘膦类型  84-85
    4.1.2 试验方法  85-86
      4.1.2.1 无菌苗培养  85
      4.1.2.2 苗期喷施试验  85
      4.1.2.3 酶粗提液提取  85-86
      4.1.2.4 POD活性和可溶性蛋白含量的测定  86
      4.1.2.5 统计分析  86
  4.2 结果与分析  86-95
    4.2.1 市售草甘膦对棉花种子发芽率的影响  86-87
    4.2.2 市售草甘膦对棉花幼苗生长的影响  87-90
    4.2.3 市售草甘膦对田间棉花幼苗生长的影响  90-93
    4.2.4 市售草甘膦对棉花幼苗POD活性的影响  93-94
    4.2.5 市售草甘膦对棉花幼苗可溶性蛋白含量的影响  94-95
  4.3 讨论  95-98
第五章 全文小结  98-101
参考文献  101-120

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 纤维作物 > 棉
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