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Synaptotagmin Ⅰ基因选择性剪接与RNA编辑的进化与功能分析

作　者: 吕剑宁
导　师: 金勇丰
学　校: 浙江大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 转录后加工选择性剪接 RNA编辑定点突变体内剪接
分类号: Q752
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

真核生物RNA的成熟通常需要经历复杂的转录后加工过程,其中包括修饰、异构、剪接和编辑等。选择性剪接在真核生物蛋白质组的扩容以及新增功能的赋予中起着重要的作用。选择性剪接的多种形式在功能调控水平上受到的重视与日俱增,特别是通过改变生物大分子局部结构的细微调控对重要功能产生的影响。本论文对无脊椎动物特别是昆虫中的synaptotagminⅠ(sytⅠ)基因(ortholog)的选择性剪接现象进行了系统分析,除了验证前人发现的剪接位点并不保守外,进一步鉴定到一更为保守的串联选择性剪接位点。同时在蚊子的sytⅠ同源基因中发现剪接补偿的新现象,即当一个剪接位点消失时会通过另一个剪接位点的出现实现对功能调控的回馈。蜜蜂sytⅠ的同源基因在相对保守的串联剪接位点上,第二个剪接受体发生了G到A的突变(其它物种均为G),失去选择性剪接的能力。为了验证该位点在进化上的保守性,我们运用了定点突变的手段(site-directed mutagenesis)将A突变为G,制作用于研究剪接的minigene,通过体外转录与剪接实验,发现了选择性剪接的重现,证明该位点在昆虫synaptotagminⅠ基因中确实是保守的,只是某些物种在基因组水平上的突变造成选择位点的缺失。同源建模表明C2B功能域上插入的2-3个氨基酸会在linker区域增加一个alpha螺旋结构。为了进一步验证该位点通过剪接对sytⅠ蛋白在功能上的影响,我们通过同源建模对两种剪接形式的蛋白结构进行了预测,通过结构的差异预测到短肽的插入或缺失可能对该功能结构域的阳离子结合能力有一定的影响。另外我们对sytⅠ经过RNA编辑的C2B结构域的功能进行了一定的探索,胰蛋白酶限制性消化结果明,编辑对蛋白质稳定性有一定的帮助。

全文目录

致谢  5-6
中英文摘要  6-9
  中文摘要  6-7
  Abstract  7-9
缩略语  9-12
第一部分  12-24
  第一章 RNA的转录后加工  13-19
    1.1 RNA剪接的基本原理  13-14
    1.2 多种选择性剪接方式  14-15
    1.3 RNA编辑与选择性剪接的相互作用  15-16
      1.3.1 ADAR2中编辑与选择性剪接的相互作用  15-16
      1.3.2 mCAT2中编辑与选择性剪接的相互作用  16
    1.4 RNA编辑方式  16-18
      1.4.1 锥虫线粒体RNA多个U的添加和去除  16-17
      1.4.2 C至U RNA编辑  17-18
      1.4.3 高等生物中的A至I RNA编辑  18
    1.5 串联选择性剪接(Tandem splicing)的研究进展  18-19
  第二章 Synaptotagmin Ⅰ的研究进展  19-21
    2.1 Synaptotagmin Ⅰ的结构与性质  19-20
    2.2 synaptotagmin Ⅰ基因中与转录水平加工相关的研究进展  20-21
  第三章实验方案设计  21-24
    3.1 实验目的和意义  21-22
    3.2 研究内容  22-23
      3.2.1 昆虫synaptotagmin Ⅰ基因选择性剪接的发现,预测,及鉴定  22
      3.2.2 人工突变对串联选择性剪接的影响  22
      3.2.3 串联选择性剪接对功能水平的影响研究  22-23
    3.3 技术路线  23-24
第二部分  24-77
  第四章 synaptotagmin Ⅰ基因选择性剪接的预测与验证  25-50
    4.1 材料与试剂  25-27
    4.2 实验方法  27-33
      4.2.1 目的基因的选择及引物设计  27-29
      4.2.2 重要步骤  29-33
    4.3 各物种synaptotagmin Ⅰ的选择性剪接  33-50
      4.3.1 各个目的基因的获得方法  33-40
      4.3.2 结果与分析  40-48
      4.3.3 讨论  48-50
  第五章 syt Ⅰ突变milli-gene体内剪接的功能研究  50-67
    5.1 基于转染的选择性剪接研究  50-59
      5.1.1 实验流程  50
      5.1.2 材料试剂及引物设计  50-51
      5.1.3 实验方法  51-55
      5.1.4 结果与分析  55-58
      5.1.5 讨论  58-59
    5.2 基于显微注射的选择性剪接研究  59-67
      5.2.1 实验流程  59-60
      5.2.2 实验方法  60-63
      5.2.3 结果与分析  63-66
      5.2.4 讨论  66-67
  第六章 Syt Ⅰ选择性剪接的功能预测  67-72
    6.1 基于建模的功能分析  67-72
      6.1.1 研究方法  67-68
      6.1.2 结果与分析  68-72
  第七章家蚕syt Ⅰ基因RNA编辑及相关功能研究  72-77
    7.1 家蚕syt Ⅰ基因RNA编辑现象的研究  72-73
      7.1.1 材料与方法  72
      7.1.2 结果与分析  72-73
    7.2 RNA编辑对SytⅠ蛋白C2B结构域功能影响:  73-77
      7.2.1 实验流程  73-74
      7.2.2 材料与方法  74
      7.2.3 结果与分析  74-77
结论  77-78
参考文献  78-81
研究生简历  81

Synaptotagmin Ⅰ基因选择性剪接与RNA编辑的进化与功能分析

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