学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

靶向基因修饰树突状细胞瘤苗治疗移植性肝癌的实验研究

作　者: 李媛媛
导　师: 谢裕安
学　校: 广西医科大学
专　业: 肿瘤学
关键词: 习树突状细胞细胞因子体外诱导流式细胞术 HEK293A 重组腺病毒主要组织相容性复合体 PAdBM5-mAFP-DC 树突状细胞移植性肝癌转基因瘤苗小鼠
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
下　载: 60次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

目的建立体外诱导和扩增小鼠骨髓来源树突状细胞（DC）的方法,并对其形态和表型进行鉴定。方法在无菌条件下提取C57BL/6J小鼠骨髓细胞,利用细胞因子rmGM-CSF（50ng/ml）和rmIL-4（2ng/ml）联合诱导,于体外培养第6天收集部分疏松贴壁细胞,行流式细胞术（FACS）检测其表型,其余细胞加入rmTNF-a（50ng/ml）继续培养,刺激其成熟,并于48小时后行流式细胞术（FACS）检测其表型。在光镜和电镜下观察DC的形态特征。结果小鼠骨髓单核细胞经细胞因子（rmGM-CSF和rmIL-4）体外诱导培养24小时后,可见增殖性细胞集落,3天后集落增多明显,培养至第7天,收集悬浮细胞在光镜和电镜下均显示细胞表面不规则,呈树突状突起,具有DC的典型形态学特征。流式细胞术检测结果显示:经细胞因子（rmGM-CSF和rmIL-4）诱导的细胞表面均表达CD11c、MHCⅡ、CD80和CD86等DC表面分子,而经rmTNF-a刺激48小时后的细胞,其表达率明显提高,分别为[（81.60±10.02）%],[（78.70±11.35）%],[（65.30±5.73）%]和[（79.65±8.66）%],提示经rmTNF-a刺激后DC趋于成熟。结论细胞因子rmGM-CSF和rmIL-4可在体外联合诱导小鼠骨髓单核细胞发育成DC,体外诱导的DC经rmTNF-a刺激后,可迅速发育成熟,采用这种方法可以体外诱导扩增大量DC。目的构建小鼠甲胎蛋白（mAFP）基因转染的树突状细胞瘤苗（pAdBM5-mAFP-DC）。方法应用HEK293A细胞作为包装细胞,大量扩增含目的基因mAFP的重组腺病毒pAdBM5-mAFP;利用改良的CsCl超速离心法对其进行纯化;用TCID₅₀法测定重组腺病毒滴度。从C57BL/6J小鼠骨髓分离单个核细胞,用重组小鼠白细胞介素4（rmIL-4）和重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）诱导和扩增DC。将重组腺病毒颗粒转染DC,用流式细胞术（FACS）检测转染前后DC细胞表面分子MHCⅠ、MHCⅡ、CD18a（LEA）、CD54（ICAM）、CD80（B7.1）、和CD86（B7.2）等的变化。结果获得了50μl纯化病毒液,病毒滴度达0.88×10⁸ PFU/ml。将纯化的重组腺病毒pAdBM5-mAFP转染体外培养的DC,经mAFP基因转染后的DC分子表面高表达MHCⅠ、MHCⅡ、CD18a、CD54、CD80和CD86等分子,其分子表达率分别为69.3%、41.0%、42.1%、63.2%、39.4%和38.6%,与转染前比较差异有统计学意义（p＜0.05）。结论重组腺病毒pAdBM5-mAFP在HEK293A细胞中可成功扩增,所得病毒液量可满足体内基因转染实验的需要。所扩增的重组腺病毒pAdBM5-mAFP可成功转染DC而构建出pAdBM5-mAFP-DC转基因瘤苗;mAFP基因修饰后的DC能表达高水平的MHCⅠ、MHCⅡ、CD18a、CD54、CD80和CD86分子。目的探讨pAdBM5-mAFP-DC瘤苗对C57BL/6J小鼠移植性肝癌发生发展的阻断作用。方法40只C57BL/6J小鼠随机分为A、B、C、D和E组,每组8只。以免疫表达mAFP基因的重组腺病毒转染DC（pAdBM5-mAFP-DC）为A组;免疫表达mAFP基因的质粒DNA（pAdBM5-mAFP）为B组,免疫表达mAFP基因的另一种质粒DNA（pcDNA3.1（+）-mAFP）为C组;免疫单纯DC为D组,以注射单纯PBS为对照组E组。免疫方法:A组和D组在每只小鼠的右腋下注射5×10⁵个细胞（0.1ml/次）,B组和C组在每只小鼠的右腋下注射10.0μg重组质粒（0.1ml/次）,E组,仅注射0.1ml PBS,每1周注射1次,连续免疫4次。在初次免疫后的第3周给所有小鼠移植Hepal-6肝癌细胞。观察小鼠移植瘤的生长情况,于移植肿瘤第14天取血,用ELISA法检测血清TNF-a和IFN-γ的水平,并处死小鼠,检查成瘤情况。同时对肿瘤组织进行组织病理学检查。结果pAdBM5-mAFP-DC瘤苗免疫可诱导强烈的免疫保护作用,瘤苗免疫小鼠能有效抵抗Hepal-6肝癌细胞的攻击,表现为肿瘤生长缓慢（至实验结束,A组有3只小鼠未长出移植瘤）。A、B、C、D和E组的瘤体重量分别为（0.05475±0.029148）g、（0.25425±0.092698）g、（0.14025±0.081074）g、（0.10400±0.027092）g、（0.29300±0.134784）g,A组瘤体重量最轻,与B、C、E组瘤体重量比较有显著性差异（P＜0.01）。计算肿瘤抑制率结果为:A组肿瘤抑制率为81.31%,显著高于其它组。各组小鼠血清中的TNF-a、IFN-γ含量结果表明:A组和D组小鼠血清中TNF-a、IFN-γ水平显著升高,A组血清中TNF-a、IFN-γ水平分别为（180.25±30.25,155.45±24.37）,D组血清中TNF-a、IFN-γ水平分别为（105.32±12.57,90.33±9.70）;A组和D组之间比较有统计学差异（p＜0.05）。组织病理学检查显示:各组肿瘤组织有不同程度的炎细胞浸润,各组比较,以A组最为明显,并以淋巴细胞浸润为主;除A组外,其他各组均见肿瘤因生长过快而血供相对不足所导致的缺血性坏死。结论将构建的pAdBM5-mAFP-DC瘤苗免疫小鼠,可以刺激小鼠体内产生强烈的抗肿瘤免疫反应,使荷瘤小鼠血清中细胞因子TNF-a、IFN-γ水平显著提高,体内诱导产生细胞毒性T细胞,向表达AFP的肝癌细胞趋化,并向肿瘤组织浸润,杀伤肿瘤细胞,从而抑制肿瘤的发生、发展。

全文目录

缩略词表  6-8
前言  8-32
  参考文献  29-32
第一部分小鼠骨髓来源的树突状细胞的诱导扩增与鉴定  32-44
  中文摘要  32-33
  英文摘要  33-35
  材料与方法  35-38
  结果  38-41
  讨论  41-43
  参考文献  43-44
第二部分 pAdBM5-mAFP重组腺病毒载体的构建  44-70
  中文摘要  44-45
  英文摘要  45-47
  材料与方法  47-60
  结果  60-65
  讨论  65-67
  参考文献  67-70
第三部分 pAdBM5-mAFP-DC瘤苗的构建  70-91
  中文摘要  70-71
  英文摘要  71-73
  材料与方法  73-80
  结果  80-83
  讨论  83-88
  参考文献  88-91
第四部分 pAdBM5-mAFP-DC瘤苗治疗小鼠移植性肝癌的研究  91-115
  中文摘要  91-93
  英文摘要  93-95
  材料与方法  95-102
  结果  102-108
  讨论  108-113
  参考文献  113-115
研究结论  115-116
综述  116-123
致谢  123

靶向基因修饰树突状细胞瘤苗治疗移植性肝癌的实验研究

内容摘要

全文目录

相似论文