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金鱼Tgf2转座子的研究及其转基因应用

作　者: 杜雪地
导　师: 邹曙明
学　校: 上海海洋大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 金鱼转座子 Tgf2 报告基因显微注射转基因
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

转座子是基因组上的一段一定长度的DNA序列,能在自身编码的转座酶或逆转录酶的作用下,发生自我剪切或复制,并且在基因组DNA中移动位置的基本单位。如青鳉Tol2转座子(Transposable element of Oryzias latipes, number 2)和鲑鱼SB转座子(Sleeping Beauty Transposon)都以―剪切-粘贴‖的方式进行转座,即转座酶对转座子进行剪切,然后介导其插入到基因组内部。研究证明Tol2转座酶识别的是转座子末端反向重复序列和亚末端重复序列,当上述区域突变之后,其转座效率会明显下降。SB转座酶识别的末端重复序列大约长230bp,由外侧的反向重复序列(inverted repeats, IR)和内侧的同向重复序列(directly repeats, DR)及两者间的序列组成。根据它们的转座机制,国外学者构建了基于Tol2和SB转座子的转基因系统,即转基因供体质粒加转座酶辅助质粒的转基因体系。研究表明,两个转基因系统都具有广泛的通用性,近几年已在转基因、基因捕获和基因治疗研究中取得了重大进展。2008年,本实验室在19种不同鱼类物种或品系中进行PCR筛选,最后在我国金鱼品系中发现了一个新的hAT家族转座子,命名为金鱼Tgf2转座子。在此基础上,本研究进一步采用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了Tgf2转座酶全长cDNA,并对其表达进行了RT-PCR和原位杂交研究;其后,对Tgf2转座子的多态性进行了研究;最后,利用Tgf2转座子的左右末端和转座酶编码框(CDS)构建了具有自主知识产权的转基因系统,并在斑马鱼、草鱼、金鱼和鲫鱼等鲤科鱼类中开展了转基因研究。主要研究结果如下:1. Tgf2转座酶全长cDNA的克隆:共克隆得到7种转录本,分别命名为gfTP-1、gfTP-2、gfTP-3、gfTP-4、gfTP-5、gfTP-6、gfTP-7;经对其编码框进行预测,发现金鱼Tgf2转座子能编码产生3种长度的转座酶,其编码框长度分别为:2061bp(gfTP-1)、1953bp(gfTP-2和gfTP-3)和1734bp(gfTP-4、gfTP-5、gfTP-6和gfTP-7),分别编码686个、650个和577个氨基酸残基;金鱼Tgf2 3种长度的转座酶间的差异主要体现在5端,与青鳉Tol2的3种转座酶序列相比较,发现两种鱼类的转座酶在序列上的相似度达99%,仅有7个氨基酸的差异。2.选取3种长度金鱼Tgf2转座酶mRNA的共有区设计引物,对金鱼不同组织总RNA进行RT-PCR分析,结果显示Tgf2转座酶基因在金鱼所有组织均有表达,以卵巢中表达量最高,其次为肝脏。对金鱼不同发育时期胚胎进行RT-PCR和整胚原位杂交分析,结果表明转座酶基因的表达模式在不同个体间具有明显时空差异。3.对珍珠、鹤顶红、红狮头、花狮头、琉金、蝶尾、龙睛、水泡眼和草金9个不同金鱼品系的基因组进行PCR分析,发现Tgf2转座子在金鱼各品系中均有分布;并揭示了在金鱼基因组中,Tgf2转座子既有完整拷贝也有包含缺失的拷贝。4.克隆了Tgf2转座子的220bp左末端和185bp右末端序列,并以此构建了基于Tgf2转座子的pTgf2-ef1α-eGFP、pTgf2-krt8-eGFP和pTgf2-ef1α-RFP转基因供体质粒;同时,利用Tgf2转座酶1734bp的编码区(编码577个氨基酸残基)构建了转座酶辅助质粒pCS2-gfTP。利用上述构建的转基因供体质粒和辅助质粒系统,在模式生物斑马鱼和常见养殖鲤科鱼类草鱼、鲫鱼及金鱼中进行了转基因研究。结果表明:Tgf2转基因系统可高效介导目的基因向受体基因组转座,在孵化后第6天(平游期),草鱼阳性率约为52%,斑马鱼阳性率约为50%,鲫鱼阳性率约为53%;在一周龄时,报告基因在金鱼基因组中的转基因整合率为96%(27/28),草鱼中为37%(73/200)。这些结果表明,本研究构建的Tgf2转基因系统可供在鲤科养殖鱼类中开展高效转基因研究。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-10
引言  10-15
第一章金鱼Tgf2 转座酶基因的克隆及表达分析  15-30
  1.1 材料、仪器与试剂  15-16
    1.1.1 实验材料  15
    1.1.2 主要仪器  15-16
    1.1.3 主要试剂  16
  1.2 方法  16-22
    1.2.1 引物设计  16-17
    1.2.2.RNA 提取  17
    1.2.3.RT-PCR  17-18
    1.2.4.RACE  18-19
    1.2.5 电泳检测与目的片段回收  19-20
    1.2.6 连接与转化  20
    1.2.7 重组子鉴定  20
    1.2.8 原位杂交  20-22
  1.3 结果  22-29
    1.3.1 小片段扩增与序列比较  22
    1.3.2 转座酶基因cDNA 全长及序列分析  22-27
    1.3.3 转座酶表达的研究  27-29
  1.4 讨论  29-30
第二章金鱼基因组中Tgf2 转座子的多态性  30-37
  2.1 材料、仪器与试剂  30-31
    2.1.1 实验材料  30
    2.1.2 主要仪器  30-31
    2.1.3 主要试剂  31
  2.2 方法  31-33
    2.2.1 引物设计  31
    2.2.2. DNA 提取  31-32
    2.2.3. PCR 扩增  32
    2.2.4 电泳检测与目的片段回收  32-33
    2.2.5 连接与转化  33
    2.2.6 重组子鉴定  33
  2.3 结果  33-35
  2.4 讨论  35-37
第三章 Tgf2 转基因系统的构建及转基因研究  37-51
  3.1 材料、仪器与试剂  37-38
    3.1.1 实验材料  37
    3.1.2 主要仪器  37-38
    3.1.3 主要试剂  38
  3.2 方法  38-44
    3.2.1 引物设计  38-39
    3.2.2 RNA 和DNA 提取  39-40
    3.2.3 PCR 扩增  40
    3.2.4 电泳检测与目的片段回收  40-41
    3.2.5 连接与转化  41-42
    3.2.6 重组子鉴定  42
    3.2.7 双酶切与质粒重组  42-43
    3.2.8 显微注射  43-44
    3.2.9 PCR 检测  44
  3.3 结果  44-49
    3.3.1 转基因系统  44-46
    3.3.2 胚胎期的荧光观察  46-47
    3.3.3 转基因阳性个体的PCR 检测  47-49
  3.4 讨论  49-51
结论与展望  51-52
参考文献  52-58
附录  58-59
致谢  59

金鱼Tgf2转座子的研究及其转基因应用

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