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粟酒裂殖酵母Trz1p核定位序列的进一步研究

作　者: 李军
导　师: 黄鹰
学　校: 南京师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 核酸内切酶tRNase Z 绿色荧光蛋白(GFP) 粟酒裂殖酵母温度敏感突变菌株
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

tRNase Z是一种核酸内切酶,能去除非编码CCA的tRNA前体3’末端多余核苷酸序列,促进tRNA3’末端加工成熟。tRNase Z属于金属-β-内酰胺酶家族,在生物体中tRNase Z有短型(tRNase Zs)和长型(tRNase ZL)两种形式,不同的生物体中有不同数量不同类型的tRNase Z.本课题主要涉及的研究是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharo-myces pombe, S.pombe)核酸内切酶tRNase Z基因的相关功能研究。在裂殖酵母(S.pombe)中编码有两个tRNase ZL基因：分别是sptrzl+(SPAC1D4.10)和sptrz2(SPAC3D6.03c)。本课题重点对裂殖酵母sptrzl+的核定位序列进行进一步分析：利用EGFP作为示踪蛋白,采用逐渐截短基因的方法,构建EGFP与不同截短蛋白的融合蛋白,观察这些融合蛋白的荧光信号分布情况,分析确定各个融合蛋白的核定位序列的细胞定位。实验发现含有208KKRK211的融合蛋白明显的分布在细胞核中,不含这四种氨基酸的融合蛋白的荧光信号散布在细胞核和细胞质中,说明trz1+基因的208KKRK211氨基酸序列在SpTrz1p入核中发挥着重要的作用。这充分证实裂殖酵母sptrzl+基因的细胞定位是在细胞核,其功能的发挥主要是在细胞核中进行。同时,采用合成寡核苷酸的方法结合截短片段的分析,进一步确定裂殖酵母sptrzl+基因中KKRK只有一个核定位序列,其序列分布存在该基因的N端,并且可以初步确定FKKRKHENINRG是其核定位序列。线粒体的tRNA加工方式与核定位的tRNA加工方式存在差异,裂殖酵母sptrz2+基因定位在线粒体,本课题期望通过研究sptrz2+基因的功能,对线粒体的tRNA 3’端加工方式有一定的突破。课题设计利用sptrz2基因温度敏感型菌株,比较温度敏感型菌株与野生型菌株sptrz2+基因tRNA 3’端加工方式的差异,从另一个角度研究分析裂殖酵母线粒体tRNA加工方式。裂殖酵母与细胞凋亡相关的基因pcdl+可能参与细胞凋亡,进一步研究发现其不参与细胞凋亡,参与细胞周期,与细胞发育有关,因此我们希望进一步研究裂殖酵母中pcdl+基因的相关功能。课题设计用随机突变与普通PCR扩增的非高度保真性的方法来构建由pcdl+基因引起的温度敏感型菌株。但遗憾的是经过一定数量的温度敏感型菌株筛选,没有得到特别适合课题需要的温度敏感菌株,为今后筛选温度敏感突变菌株的合适条件探索奠定了一定的基础。

粟酒裂殖酵母Trz1p核定位序列的进一步研究

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