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一种启动子探针载体的构建及低温诱导启动子的研究

作　者: 沈林丽
导　师: 李大力
学　校: 南京理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 绿色荧光蛋白(GFP) 启动子探针载体 CspA启动子 低温诱导 载体构建
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


启动子是基因表达调控的重要元件,也是基因工程表达载体的一个重要元件。启动子克隆技术包括启动子探针质粒载体筛选启动子和利用PCR技术克隆启动子。绿色荧光蛋白是从多管水母体内发现的,它可以在蓝光或紫外光激发下发射绿光。由于它稳定的结构和光物理性质,又易于在细胞内表达,近些年作为标记物已经被广泛地应用于生命科学领域。本文以质粒pAcGFP为骨架,构建以绿色荧光蛋白为报告基因的启动子探针载体。用一段约700bp的基因片段插入pAcGFP中取代其上的lac启动子,获得中间载体pEH+GFP。人工合成一段特异核糖体结合位点(RBS)序列插入到pEH+GFP中得到载体pEH+GFP+RBS。最终构建成以绿色荧光蛋白为报告基因的启动子探针载体pGFP+RBS,并用它从铜绿假单胞菌的总DNA中成功钓出一段具有启动表达GFP的功能的基因片段,初步分析该片段为组成型启动子。CspA是大肠杆菌中一种主要的冷激蛋白,近来研究人员对其结构、功能和在转录、翻译水平的调控以及mRNA稳定性等方面作了大量研究。本文用PCR技术克隆CspA启动子构建包含CspA冷激启动子的低温表达载体,用以在低温条件下诱导表达目的蛋白。以大肠杆菌DNA为模板,用人工合成引物经PCR扩增获得大肠杆菌冷激蛋白CspA的低温诱导启动子(cold启动子)片段,插入到表达型质粒pET30a(+)的T7启动子片段中,以取代pET30a(+)原有启动子,构建低温诱导表达型载体pET30a/cold。通过克隆表达精氨酸脱亚胺基酶(ADI)来验证pET30a/cold的低温诱导启动子的功能和启动子强度。报告基因ADI蛋白的SDS-PAGE分析,表明pET30a/cold-ADI在低温下的表达效率与pET30a-ADI在37℃IPTG诱导表达效率相近。克隆的Cold启动子片段包含了冷激蛋白cspA的完整的中心启动子,具有在低温下诱导表达目标蛋白的功能。并且,可以达到很高的表达效率,构建的低温诱导表达载体pET30a/cold可以作为一种工程工具为以后科研工作打下基础。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-6
目录  6-8
符号与缩略语说明  8-9
1 前言  9-16
  1.1 原核生物启动子的结构模型  9
  1.2 启动子的分类  9-10
  1.3 启动子克隆的意义  10
  1.4 启动子克隆的方法  10-12
    1.4.1 利用启动子探针质粒载体筛选启动子  10-11
    1.4.2 利用PCR技术克隆启动子  11-12
  1.5 大肠杆菌冷激蛋白启动子的研究  12-16
    1.5.1 大肠杆菌的冷激蛋白CspA及其家族成员  13
    1.5.2 冷激蛋白CspA核心启动子  13-14
    1.5.3 冷激蛋白cspA mRNA的5'-UTR  14-15
    1.5.4 冷激启动子应用研究的意义  15-16
2 以绿色荧光蛋白为报告基因的启动子探针载体构建和应用  16-33
  2.1 材料与试剂  16-18
    2.1.1 主要仪器  16-17
    2.1.2 主要试剂  17
    2.1.3 实验用菌株和质粒  17
    2.1.4 培养基及主要溶液的配制  17-18
  2.2 实验方法  18-26
    2.2.1 大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备  18-19
    2.2.2 连接产物转化DH5a感受态细胞  19
    2.2.3 质粒的提取  19
    2.2.4 基因片段琼脂糖凝胶电泳切胶回收  19-20
    2.2.5 以绿色荧光蛋白基因为报告基因的启动子探针载体的构建  20-24
    2.2.6 启动子探针载体pGFP+RBS探针特性的证实  24-26
    2.2.7 筛选出的启动子性质测定  26
  2.3 实验结果  26-30
    2.3.1 以绿色荧光蛋白基因为报告基因的启动子探针载体的构建  26-28
    2.3.2 pGFP+RBS启动子探针特性的证实  28-29
    2.3.3 未知启动子promoterl性质的初步研究  29-30
  2.4 讨论  30-33
    2.4.1 启动子探针载体pGFP+RBS的优点  30-31
    2.4.2 使用启动子探针载体pGFP+RBS筛选启动子的注意点  31-33
3 cold启动子的克隆和低温诱导表达载体的构建  33-53
  3.1 材料与试剂  33-34
    3.1.1 菌株和质粒  33
    3.1.2 主要试剂  33
    3.1.3 主要溶液的配制  33-34
  3.2 实验方法  34-42
    3.2.1 低温诱导表达载体构建及性质鉴定策略  34-35
    3.2.2 cold启动子基因的PCR扩增  35-37
    3.2.3 PCR产物的TA克隆  37-38
    3.2.4 低温诱导表达载体的构建  38-39
    3.2.5 低温诱导表达载体pET30a/cold的性质鉴定  39-42
  3.3 实验结果  42-49
    3.3.1 E.coli cspA基因上游启动子序列的扩增  42
    3.3.2 cold启动子TA克隆鉴定  42-43
    3.3.3 cold启动子序列测序鉴定  43-44
    3.3.4 低温诱导表达载体pET30a/cold的构建  44-45
    3.3.5 低温诱导表达载体pET30a/cold的应用  45-46
    3.3.6 cold启动子介导的低温诱导ADI表达研究  46-49
  3.4 讨论  49-53
    3.4.1 cold启动子结构分析  49-50
    3.4.2 低温诱导表达载体应用意义  50-51
    3.4.3 cold启动子构建的低温诱导表达载体存在的问题  51-53
4 结论与展望  53-54
  4.1 结论  53
  4.2 展望  53-54
致谢  54-55
参考文献  55-58

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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