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马铃薯原生质体遗传转化体系的构建

作　者: 黄亚玲
导　师: 谢从华
学　校: 华中农业大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 马铃薯 原生质体 遗传转化 绿色荧光蛋白(GFP)
分类号: S532
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


马铃薯（Solanum tuberosum L．）是世界第四大粮食作物且用途广泛，发展其生产具有重要的意义。近年来，马铃薯常规育种工作遇到了难以跨越的“生物学路障”，而基因工程技术对于转移目标性状具有很大的目的性，已经成为目前改良作物品性的重要手段。原生质体作转化受体较传统外植体更能整合大片段DNA，但目前马铃薯这方面的研究还不够充分。 本研究以马铃薯无性系8#（2n=4x=48）为材料，分离其叶肉原生质体作转化受体，选用绿色荧光蛋白（GFP）基因作为报告基因，采用共孵育（原生质体与质粒DNA直接融合）法，PEG介导转化法和电击穿孔转化法，将外源质粒（pBIN m-gfp5-ER和SK-gfp）DNA转化到马铃薯原生质体中。通过转化子中绿色荧光蛋白的表达，研究马铃薯原生质体遗传转化技术体系。主要结果如下： 1．SK-gfp转化载体的构建 从pBIN m-gfp5-ER（14.7kb）上酶切出gfp基因，装入SK载体，构建SK-gfp质粒，长度约4.8kb，gfp基因经序列测定，与pBIN m-gfp5-ER上gfp序列比对，相似性为100％。 2．共孵育 即将一定浓度的外源DNA（60、80、100μg／mL）和纯化后的原生质体直接共培养，共得到163个愈伤组织，其中转化子30个，转化效率18.4％。 3．PEG介导转化 纯化后的原生质体用PSL（甘露醇0.3mol／L，MgCL2 15mmol／L，MES 0.1％，pH 5.8，高温灭菌）悬浮，加入一定浓度的质粒DNA（75、100μg／mL），充分混匀后静置片刻，然后均匀地滴于无菌培养皿的底部，静置3min，待大多数细胞沉降后，在每滴正上方加等量的12.5％或25％的PEG溶液，分别静置10min或5min，诱导外源DNA进入原生质体。共得到愈伤组织149个，有70个是转化子，转化效率为47.0％，其中PEG（12.5％，10min）的转化效率为51.9％，高于PEG（25％，5min）的44.2％，且二者之间在P=0.05水平上存在显著性差异。 4．电击穿孔转化 电转化仪：Eppendorf Multiporator 4308型，转化室为250μL螺旋型铂金电极，间距0.02cm；电转化液的组成：0.35mol／L甘露醇+0.1mMCaCl2，pH 5.8，高温灭菌；脉冲电压为20v，脉冲次数n=1。得到愈伤组织312个，其中转化子183个，转化效率最高，达到58.7％。 5．比较外源DNA长度对转化效率的影响时发现，共培养转化和电击穿孔转化时，SK-gfp的转化效率比pBIN m-gfp5-ER的高；而在PEG介导转化中出现了相反的情况。 6．通过研究DNA浓度与转化效率的关系发现：只有在共培养转化时，DNA浓度为80μg／mL的转化效率与60、100μg／mL的效率在P=0.05水平上存在显著性差异，PEG介导转化和电击穿孔转化时设立的两浓度（75、100μg／mL）所对应的转化效率不存在显著性差异。 7．三种转化方法共得到愈伤组织624个，其中转化子283个。对三种转化方法

全文目录


目录  4-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
缩略词表  11-12
1.前言  12-22
  1.1 课题的提出  12-13
  1.2 前人研究进展  13-20
    1.2.1 植物原生质体培养  13
    1.2.2 植物原生质体遗传转化研究概况  13-18
      1.2.2.1 PEG介导的原生质体转化  14-15
      1.2.2.2 电击穿孔转化  15-16
      1.2.2.3 农杆菌共培养转化  16-17
      1.2.2.4 脂质体介导转化  17-18
      1.2.2.5 其它  18
    1.2.3 GFP在遗传转化中的应用  18-20
  1.3 实验目的及意义  20
  1.4 研究内容  20-22
2.材料方法  22-31
  2.1 实验材料  22-24
    2.1.1 植物材料  22
    2.1.2 菌株、载体、酶和试剂  22
    2.1.3 质粒DNA抽提液配方  22
    2.1.4 培养基  22-24
      2.1.4.1 LB培养基  22
      2.1.4.2 无菌苗繁殖培养基  22
      2.1.4.3 原生质体培养各阶段培养基  22-24
  2.2 实验方法  24-31
    2.2.1 无菌苗的培养  24
    2.2.2 原生质体的制备  24
    2.2.3 原生质体活力检测  24-25
    2.2.4 大肠杆菌DH5α菌株感受态细胞的制备  25
    2.2.5 SK-gfp转化载体的构建  25-27
    2.2.6 质粒DNA的抽提与纯化  27-28
      2.2.6.1 碱裂解法大量制备质粒DNA  27-28
      2.2.6.2 质粒DNA检测  28
    2.2.7 原生质体转化  28-29
      2.2.7.1 共孵育  29
      2.2.7.2 PEG介导转化  29
      2.2.7.3 电击转化  29
    2.2.8 转化后原生质体的培养  29-30
    2.2.9 转化子的鉴定  30
    2.2.10 实验结果统计方法  30-31
3.结果与分析  31-40
  3.1 SK-gfp质粒载体  31-33
  3.2 原生质体纯化  33-34
  3.3 转化后原生质体培养状况  34-36
    3.3.1 转化子中绿色荧光蛋白的表达  34
    3.3.2 各培养阶段的状态  34-35
    3.3.3 愈伤组织形成进程  35-36
  3.4 共孵育  36-37
    3.4.1 质粒DNA浓度对转化效率的影响  36
    3.4.2 pBIN m-gfp5-ER和SK-gfp转化效率的比较  36-37
  3.5 PEG介导的转化  37-38
    3.5.1 质粒DNA浓度对转化效率的影响  37
    3.5.2 pBIN m-gfp5-ER和SK-gfp转化效率比较  37-38
    3.5.3 PEG(12.5％,10min)与PEG(25％,5min)转化效率比较  38
  3.6 电击转化  38-40
    3.6.1 质粒DNA的量对转化效率的影响  38-39
    3.6.2 pBIN m-gfp5-ER和SK-gfp转化效率比较  39-40
4.讨论  40-43
  4.1 三种转化方法比较  40
  4.2 PEG介导的转化  40
  4.3 外源DNA浓度对转化效率的影响  40-41
  4.4 外源DNA大小对转化效率的影响  41
  4.5 原生质体转化后绿色荧光蛋白的表达  41
  4.6 本转化体系的有效性  41
  4.7 研究展望  41-43
参考文献  43-48
致谢  48

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 薯类作物 > 马铃薯（土豆）
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