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JWA在氯化镉诱导的HEK-293T细胞凋亡中的作用及其分子机制

作　者: 曹兴江
导　师: 周建伟
学　校: 南京医科大学
专　业: 劳动卫生与环境卫生学
关键词: JWA 启动子 镉 NIH-3T3细胞 HEK-293T细胞 细胞凋亡 活性氧 MAPKs
分类号: Q25
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


随着人类基因组计划（HGP）的完成，以研究基因组结构和功能关系为主要内容的后基因组计划如环境基因组计划（EGP）等已成为当前生命科学领域的研究热点。目前对许多环境污染物导致健康损害尚缺乏有效防治手段，其主要原因是对“环境-机体应答体系”缺乏本质的认识，在基因水平研究环境有害因素所致损伤和机体防御的相互作用，是认识环境-机体应答体系的重要基础。JWA基因是周建伟等从培养的原代人的气管和支气管上皮细胞中分离克隆的一个在生物进化上高度保守的环境应答基因。本课题主要从两个方面对JWA基因进行了研究：第一，初步分析了JWA启动子的活性；第二，初步探讨了JWA在环境致癌物镉所诱导的细胞凋亡中的作用及可能的分子机制。第一部分JWA基因启动子在NIH-3T3细胞中的活性分析1、在本实验室陈瑞博士成功构建的JWA启动子区域系列报告基因质粒的基础上，我们采用瞬时转染和荧光素酶报告基因技术检测了JWA启动子区系列报告基因在NIH-3T3细胞中的转录活性。结果发现，JWA启动子区-194／+107序列和-107／+107序列的转录活性显著高于其他片断，且-194／+107序列的转录活性亦明显强于-107／+107序列。2、为进一步确认JWA启动子区的核心调控序列，我们构建了JWA启动子区-194／-107序列的荧光素酶报告基因质粒并检测了该序列的转录活性。结果表明，-194／-107序列的转录活性高于-194／+107序列；Southwestern实验表明该段存在能与某一分子量为32kD的转录因子结合的调控序列。3、进一步将-194／-107序列分成两段寡核苷酸序列（-194／-147和-156／-107）合成，生物素标记，用EMSA和Southwestern实验研究发现，只有-194／-147序列能与分子量为32kD左右的转录因子结合，提示在NIH-3T3细胞内，JWA的核心调控序列可能在-194／-147范围。第二部分JWA在氯化镉诱导的HEK-293T细胞凋亡中的作用及其分子机制1、本研究用MTT方法检测发现，CdCl2能抑制HEK-293T细胞生长，且随CdCl2的处理浓度（0-80μM）和时间（0-48 h）的增加而加重，呈时间-和剂量依赖关系。分别用浓度为5μM、10μM、20μM和40μM的CdCl2处理HEK-293T细胞12h后，Hoechst 33258染色实验结果显示，不同浓度的Cdel2均可诱导HEK-293T细胞凋亡，且发现细胞凋亡率与CdCl2的处理浓度呈一定的正相关关系。2、为了研究JWA在CdCl2诱导的细胞凋亡中是否起作用，我们首先用免疫印迹试验检测了JWA蛋白的表达。结果显示，分别用浓度为5μM、10μM、20μM和40μM的CdCl2处理HEK-293T细胞12 h后，随CdCl2处理浓度的增加，JWA蛋白的表达也增加。为了进一步研究JWA在CdCl2诱导的HEK-293T细胞凋亡过程中的作用，我们采用瞬时转染和反义技术使JWA蛋白的表达下调，进一步用Hoechst 33258染色实验观察JWA对CdCl2诱导的HEK-293T细胞凋亡的影响。结果显示，与对照相比，当JWA蛋白表达缺陷时，加重了CdCl2诱导的HEK-293T细胞凋亡（P＜0.05）。3、为了探讨在CdCl2诱导的HEK-293T细胞凋亡过程中是否是通过氧化应激的途径而使JWA的表达上调，我们分别用DE和DCFH-DA两种荧光染料来检测CdCl2处理后细胞内的O2-·和H2O2水平。结果显示，用20μM CdCl2处理HEK-293T细胞12 h后，细胞内的O2-·和H2O2水平都增加，提示CdCl2有可能通过诱导细胞内ROS的产生而进一步诱导JWA的表达上调。分别用浓度为5μM、10μM、20μM和40μM的CdCl2处理HEK-293T细胞12 h后，我们用免疫印迹实验检测了CdCl2对MAPKs的影响。结果显示，10μM、20μM和40μM的CdCl2处理HEK-293T细胞12 h后，ERK和JNK被激活，而p38并未受影响。为了研究CdCl2是否通过转录调控机制诱导JWA表达的上调，我们应用荧光素酶报告基因实验检测CdCl2对JWA不同启动子片断转录活性的影响。结果显示，用20μM CdCl2处理HEK-293T细胞12 h后，与对照组相比，-1680／+107和-257／+107两段启动子的转录活性显著增加，提示CdCl2可能通过激活了细胞内能与-257／+107启动子片断中某些顺式反应元件结合的核转录因子，促进了JWA基因的转录，进而使JWA蛋白的表达增加。

全文目录


缩略语  3-5
中文摘要  5-8
英文摘要  8-12
前言  12-15
材料与方法  15-29
结果  29-38
讨论  38-43
小结  43-45
参考文献  45-50
附录  50-58
致谢  58-59
综述  59-73

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中图分类: > 生物科学 > 细胞生物学 > 细胞生理学
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