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快速检测β-珠蛋白基因突变的荧光定量PCR技术的建立及应用

作　者: 周代锋
导　师: 鲍时翔；蔡望伟
学　校: 华南热带农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: β-珠蛋白基因珠蛋白生成障碍性荧光定量 PCR基因分析海南省
分类号: R450
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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引　用: 5次
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内容摘要

本研究旨在建立快速检测中国人群中6种最常见的β-珠蛋白基因突变类型的荧光定量PCR技术,并将该技术应用于β-地中海贫血(简称β-地贫)的基因诊断和产前基因诊断。首先在等位基因特异性PCR的基础上,应用SYBR green I荧光染料建立了针对中国人中6种最常见β-珠蛋白基因突变类型,即CD41-42(-CTTT)缺失突变、TATA盒nt-28(A→G)突变、IVSII654(C→T)突变、CD71-72(+A)移码突变、CD17(A→T)无义突变和CD26(G→A)突变的荧光定量PCR检测方法。用建立的荧光定量PCR技术检测了上述6种最常见β-珠蛋白基因突变类型的阳性样本DNA,其基因分型结果与DNA测序结果完全相符,基因分型结果的特异性和准确率为100%。应用上述建立的6种β-珠蛋白基因突变类型的荧光定量PCR,成功地对20个β-地贫家系共68例研究对象进行了基因诊断和产前基因诊断,在66例β-地贫患者和携带者中,共有64例检测出了包含在上述6种β-珠蛋白基因突变范围内的突变,检出率达97%,共检出13种β-珠蛋白基因突变类型,其中CD41-42/N 25例,占37.88%,CD41-42突变纯合子8例,占12.12%,nt-28/N和IVSII654/N各7例,各占10.61%, CD41-42/ IVSII654双重杂合子5例,占7.58%,CD41-42/ nt-28双重杂合子3例,占4.55%,CD71-72/N和CD41-42/ CD71-72双重杂合子各2例,各占3.03%,CD17/N、CD26/N、CD41-42/ CD17双重杂合子、nt-28/ IVSII654双重杂合子和CD71-72/CD26双重杂合子各1例,各占1.52%,未知突变2例,占3.03%。研究结果表明,本研究建立的针对中国人中6种最常见β-珠蛋白基因突变类型的荧光定量PCR检测方法,具有特异性高、成本低、快速简便的特点,适合于对大规模人群进行β-地贫基因突变的筛查,将为高效、快速、准确地开展β-地贫的基因诊断和产前基因诊断,搞好β-地贫的防治工作提供一个技术平台。应用上述建立的6种β-珠蛋白基因突变类型的荧光定量PCR分析了1872例海南汉族人和2248例海南黎族人中6种最常见β-珠蛋白基因突变类型的基因型和基因频率分布特点。研究结果表明,海南汉、黎族人群均是β-地贫的高发群体。在海南汉族人中β-地贫的携带率为2.08%,等位基因频率为0.0104,基因突变类型以CD41-42(-CTTT)缺失突变最多见,其次是TATA盒nt-28(A→G)突变、IVSII654(C→T)突变和CD71-72(+A)移码突变,突变类型较复杂、异质性较高;而在海南黎族人中β-地贫的携带率为8.10%,等位基因频率为0.0405,基因突变类型比较单一,几乎全是CD41-42(-CTTT)缺失突变,未发现其它5种β-地贫突变类型。以上研究结果初步提供了海南汉、黎族人β-地贫基因突变的基因型和基因频率分布特点,为在海南省汉、黎族人群中开展地贫的防治工作提供了科学依据;此外,为研究我国群体遗传学、人类学、民族源流和变迁提供了分子遗传学依据。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-9
1 前言  9-24
  1.1 β-地中海贫血的研究进展  9-19
    1.1.1 血红蛋白基因（Hb gene）  9-10
    1.1.2 β-地中海贫血的形成及其分子基础  10-12
    1.1.3 β-地中海贫血基因型与表型的关系  12-15
    1.1.4 β-地中海贫血基因频率及分布  15-16
    1.1.5 β-地中海贫血基因诊断  16-19
  1.2 实时荧光定量PCR 的研究进展  19-23
    1.2.1 实时荧光定量PCR 的原理  19
    1.2.2 实时荧光定量PCR 的荧光化学  19-21
    1.2.3 实时荧光定量PCR 的特点  21
    1.2.4 实时荧光定量PCR 的定量方法  21-22
    1.2.5 实时荧光定量 PCR 技术的应用  22-23
  1.3 本研究的目的和意义  23-24
  1.4 技术路线  24
2. 材料与方法  24-37
  2.1 材料  24-26
    2.1.1 主要实验仪器  24-25
    2.1.2 主要实验试剂  25
    2.1.3 研究对象  25-26
  2.2 实验分析方法  26-37
    2.2.1 血液标本的采集及处理  26
    2.2.2 基因组DNA 提取  26
    2.2.3 建立检测中国人群中6种最常见β-地贫基因突变类型的实时荧光定量PCR  26-36
    2.2.4 分析海南汉、黎族人群中6 种最常见β-地中海贫血的基因突变类型、携带率和分布特点  36
    2.2.5 应用实时荧光定量 PCR 对海南省重型β-地中海贫血患者进行基因诊断和产前基因诊断  36-37
3. 结果与分析  37-70
  3.1 β-珠蛋白基因DNA 片段的扩增和测序  37-38
  3.2 用实时荧光定量 PCR 进行中国人群中6 种最常见β-地贫基因突变类型检测的基因分型结果及DNA测序验证结果  38-62
    3.2.1 CD41-42（-CTTT）缺失突变位点实时荧光定量 PCR 的基因分型结果及测序验证结果  38-42
    3.2.2 TATA 盒nt-28（A→G）突变位点实时荧光定量 PCR 的基因分型结果及测序验证结果  42-46
    3.2.3 IV511654（C→T）突变位点实时荧光定量PCR 的基因分型结果及DNA 测序验证结果  46-50
    3.2.4 CD71-72（+A）移码突变位点实时荧光定量PCR 的基因分型结果及DNA 测序验证结果  50-54
    3.2.5 CD17（A→T）无义突变位点实时荧光定量 PCR 的基因分型结果及 DNA 测序验证结果  54-58
    3.2.6 CD26（G→A）突变位点实时荧光定量 PCR 的基因分型结果及DNA 测序验证结果  58-62
  3.3 海南汉、黎族人群中6 种最常见β-地中海贫血的基因突变类型、携带率和等位基因频率的分布特点  62
    3.3.1 海南汉族人群中6 种最常见β-地中海贫血的基因突变类型、携带率和等位基因频率的分布特点  62
    3.3.2 海南黎族人群中6 种最常见β-地中海贫血的基因突变类型、携带率和等位基因频率的分布特点  62
  3.4 应用实时荧光定量 PCR 对海南省重型β-地中海贫血患者进行基因诊断和产前基因诊断  62-70
4. 讨论  70-74
  4.1 检测中国人群中6 种最常见β-地中海贫血基因突变类型的实时荧光定量 PCR 方法的建立  70-71
  4.2 海南汉、黎族人群中6 种最常见β-地中海贫血的基因突变类型和携带率的分布特点  71-73
  4.3 应用实时荧光定量PCR 对海南省20 个β-地中海贫血家系进行基因诊断和产前基因诊断  73-74
5 结论  74-76
参考文献  76-86
英文缩略词表  86-88
附录攻读硕士研究生期间主持、参加的科研课题和发表的科研论文  88-90
致谢  90

快速检测β-珠蛋白基因突变的荧光定量PCR技术的建立及应用

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