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牦牛血红蛋白的基因克隆和同源模建

作　者: 袁青妍
导　师: 谢庄
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 牦牛 α珠蛋白基因 β珠蛋白基因 微卫星多态性 同源模建
分类号: S823.85
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
下　载: 358次
引　用: 2次
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内容摘要


世界牦牛起源于中国,全世界牦牛数量的95%分布在中国。现代的家养牦牛是中国古羌人（即现代藏族人的祖先）在距今大约5000-10000年左右的旧石器时代驯化野牦牛而来的。它们主要分布在海拔3000m以上的寒冷、低氧地区,那里的空气氧含量只为海平面的1/3～1/2。牦牛长期生活在这种寒冷、低氧环境下,不仅能正常繁育后代,而且能为藏族人民提供奶、肉、皮、毛、绒等生活必需品,素有“高原之舟”的美称。它不仅血红蛋白含量高,而且血红蛋白的氧亲和力也高。Lalthantluanga及Weber等人认为牦牛血红蛋白氧亲和力高主要是由于其βⅡ链第135位的缬氨酸代替丙氨酸所致。他们只是从一级结构上预测,没有进一步从高级结构上进行阐明。血红蛋白主要在血液中起传送O2及CO2的作用,它在牦牛适应高原低氧中起着重要的作用。我们首先克隆测定牦牛珠蛋白基因的核苷酸序列,然后从数据库中调出牦牛血红蛋白αⅠ及BⅡ珠蛋白链的氨基酸序列,运用分子模拟软件InsightⅡ来同源建牦牛血红蛋白的四级结构,以期揭示牦牛血红蛋白高氧亲和力的分子基础与结构基础。 我们利用山羊、人及黄牛中α珠蛋白基因的保守序列设计引物来扩增牦牛的α珠蛋白基因,结果得到一条长度为754bp的片段。经鉴定所测序列为牦牛α1珠蛋白基因。它与黄牛的同源性最高,为99.71%,水牛次之,为98.58%,而与山羊、绵羊、马、人的同源性较差,分别为96.03%、95.57%、68.55%、51.13%。以所测序列设计引物来扩增两个内含子,结果两个内含子都只扩增到一条片段。运用起始密码子及终止密码子附近的序列设计引物扩增牦牛α珠蛋白基因间区域,结果得到一条2470bp的片段。将它进行同源性搜索,发现没有一个基因与它同源,也即此区域内不存在任何基因。为了鉴定两个α珠蛋白基因在染色体上的排列顺序,重新设计了两对引物来分别扩增上游基因及下游基因。结果上游基因扩到一条1086bp的片段,而下游基因也扩到一条1140bp的片段。上游基因克隆测序鉴定后为α1珠蛋白基因,下游基因克隆测序鉴定后为α2珠蛋白基因。以上研究表明牦牛中存在两个长度都为706bp的非等位α珠蛋白基因,即α1珠蛋白基因、α2珠蛋白基因。它们在染色体上紧密排列,间距为2409bp。其中α1珠蛋白基因排列在前,α2珠蛋白基因在后。 利用黄牛的β珠蛋白基因序列分别设计3对和1对引物来扩增牦牛的β珠蛋白基

全文目录


中文摘要  8-10
英文摘要  10-12
第一部分 文献综述  12-40
  第一章 牦牛的分类、起源、生物学特性及其主要类群  12-17
    1．牦牛的分类地位  12
    2．牦牛的起源及驯化  12-13
    3．牦牛的生物学特性  13-14
      3．1 牦牛对缺氧环境的适应性  13
      3．2 牦牛耐寒惧热的特性  13-14
      3．3 牦牛对高山草原环境的适应性  14
      3．4 牦牛的驮乘特性  14
    4．中国主要牦牛品种(类群)  14-16
      4．1 天祝白牦牛  14-15
      4．2 九龙牦牛  15
      4．3 青海高原牦牛  15
      4．4 麦洼牦牛  15
      4．5 西藏高山牦牛  15-16
    5．野牦牛  16
    参考文献  16-17
  第二章 牦牛及其它动物对高原低氧适应的研究进展  17-28
    1．低氧适应的血液学特征  17-19
      1．1 红细胞(RBC)数、血红蛋白(Hb)含量特征  17-18
      1．2 Hb的氧亲和力特征  18-19
      1．3 血液的粘滞性特征  19
    2．低氧适应的肺动脉结构特征  19-20
    3．低氧适应的心、胸、肺特征  20-21
    4．低氧适应的其他方面特征  21
    5．低氧诱导因子在低氧适应中的作用  21-22
    6．低氧适应的遗传性  22-23
    参考文献  23-28
  第三章 血红蛋白及其研究进展  28-34
    1．血红蛋白的组成  28
    2．血红蛋白三维结构的确定  28
    3．珠蛋白基因的表达与调控  28-29
    4．血红蛋白的协同效应与变构效应  29
    5．血红蛋白的波尔效应  29-30
    6．血红蛋白的蛋白质水平研究进展  30-31
    7．血红蛋白的核酸水平研究进展  31-32
    参考文献  32-34
  第四章 血红蛋白同源模建的研究进展  34-40
    1．蛋白质三维结构的实验确定方法  34-35
      1．1 X射线晶体学  34
      1．2 电子晶体学及电子显微学三维重构  34
      1．3 多维核磁共振方法  34
      1．4 扫描隧道与原子力学显微镜技术  34
      1．5 各种谱学方法  34-35
    2．蛋白质三维结构的理论预测方法  35-36
      2．1 同源和比较建模法  35
      2．2 反向折叠法  35
      2．3 从头预测法  35-36
    3．血红蛋白同源模建的研究进展  36-38
      3．1 中央腔周围氨基酸残基不同引起氧亲和力变化  36
      3．2 接触区残基的变化引起氧亲和力变化  36-37
      3．3 键的形成影响氧亲和力  37
      3．4 蛋白质的修饰结构  37
      3．5 血红蛋白同源模建的可靠性  37
      3．6 其他方面  37-38
    参考文献  38-40
第二部分 中国牦牛珠蛋白基因的克隆、鉴定及多态性分析  40-75
  第一章 中国牦牛α-及β-珠蛋白基因的克隆、鉴定及分析  40-69
    1．实验材料  41-43
      1．1 DNA样品  41
      1．2 引物合成  41-42
      1．3 试剂盒及药品  42
      1．4 菌株、载体  42
      1．5 主要仪器  42
      1．6 试剂配制  42-43
    2．实验方法  43-47
      2．1 牦牛耳组织基因组DNA的提取  43
      2．2 牦牛血液基因组DNA的提取  43-44
      2．3 JM109感受态细菌的制备(氯化钙法)  44
      2．4 转化  44
      2．5 质粒DNA的提取  44-45
      2．6 扩增牦牛珠蛋白基因所用体系和程序  45-46
      2．7 扩增片段的回收纯化  46
      2．8 回收片段加A及与载体的连接  46-47
      2．9 克隆的挑选及鉴定  47
    3．结果与分析  47-67
      3．1 α-珠蛋白基因的结果与分析  47-56
      3．2 β-珠蛋白基因的结果与分析  56-67
    参考文献  67-69
  第二章 中国四个海拔牦牛群体血红蛋白β链微卫星多态性分析  69-75
    1．材料和方法  69-70
      1．1 样本的采集和基因组DNA的的制备  69
      1．2 PCR扩增与检测  69
      1．3 数据分析  69-70
    2．结果  70-72
      2．1 不同海拔高度牦牛的等位基因  70-71
      2．2 不同海拔高度牦牛等位基因的杂合度及多态信息含量  71
      2．3 不同海拔高度牦牛的基因型  71-72
    3．讨论  72-74
    参考文献  74-75
第三部分 牦牛血红蛋白的同源模建  75-94
  1．材料和方法  76-78
    1．1 材料  76
    1．2 血红蛋白中血红素的参数化  76-77
    1．3 在Discover力场下定位氢键的方向  77
    1．4 突变氨基酸侧链的定位  77
    1．5 能量最小化过程  77
    1．6 结构分析  77-78
  2．结果与分析  78-90
  3．讨论  90-93
  参考文献  93-94
第四部分 结论  94-95
第五部分 创新点  95-96
攻读博士学位期间发表的论文  96-97
专业术语  97-98
致谢  98

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 牛 > 品种 > 牦牛
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