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薰衣草芳樟醇合成酶的基因克隆、功能鉴定及转基因技术的研究

作　者: 张雪荣
导　师: 慈忠玲
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 林木遗传育种
关键词: 薰衣草单萜芳樟醇合成酶 Southern Blotting Northern Blotting
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 255次
引　用: 8次
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内容摘要

通过RT-PCR方法用兼并引物从薰衣草中克隆了一个600bp的序列。在Genebank里进行序列比对后与芳樟醇合成酶具有最大的相似性,为76%。通过3’RACE和5’RACE技术克隆到了基因的全长cDNA序列,为1809bp,其蛋白序列为603个氨基酸。蛋白序列与单萜类合酶基因的蛋白序列进行比对,此序列具有单萜类合酶的所有保守氨基酸功能序列DDXXD以及5端的RR功能基团。核酸及蛋白序列功能分析表明所克隆的基因属于芳樟醇合酶基因家族,命名为Llis。设计全长引物,得到了Llis的全长cDNA。用全长引物从薰衣草中克隆到了基因组全长序列,为2320bp。对其进行分析表明,基因组序列含有6个内含子,7个外显子。Southern Blotting结果表明在薰衣草中Llis可能存在2个拷贝数。构建了Llis的原核表达载体、植物转基因表达正义及反义载体。原核表达结果表明表达出来的蛋白与所预期的蛋白大小是一致的,约为60KD。用植物表达载体经烟草叶盘转化法侵染了野生型烟草。通过ppt的筛选以及提取烟草基因组,用PCR的方法得到了转基因烟草的阳性植株。Northern Blotting结果分析表明转基因烟草的正义和反义植株都有了表达,有些没有表达可能是发生了基因沉默。以百合为材料,摸索了百合的生长愈伤以及分化的条件,为下一步的百合转基因做好了基础。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
1 引言  8-22
  1.1 研究的目的和意义  8
  1.2 植物香味基因工程的研究进展  8-15
    1.2.1 香味植物  9
    1.2.2 植物香味物质的表达部位  9
    1.2.3 植物毛状体基因调控  9-10
    1.2.4 植物香味物质的组成成分  10
    1.2.5 植物香味物质的合成途径  10-13
    1.2.6 植物香味基因工程的研究  13-15
  1.3 原核蛋白表达  15-17
    1.3.1 蛋白质在大肠杆菌中表达的策略  16-17
    1.3.2 外源基因的表达  17
  1.4 观赏植物育种的研究进展  17-22
    1.4.1 我国园林花卉业发展现状  17-18
    1.4.2 花卉传统育种的现状  18
    1.4.3 与园林植物相关的基因克隆与转化的研究进展  18-20
    1.4.4 现代生物技术在花卉育种中的应用  20
    1.4.5 生物技术在花卉育种应用中存在的问题及展望  20-22
2 材料与方法  22-36
  2.1 实验材料  22-25
    2.1.1 植物材料  22
    2.1.2 菌株和质粒  22
    2.1.3 分子生物学及生化试剂  22-23
    2.1.4 培养基  23
    2.1.5 常用的试剂  23-25
  2.2 实验方法  25-36
    2.2.1 烟草再生体系的调整及选择压力的筛选  25-26
    2.2.2 百合再生体系的探索  26
    2.2.3 芳樟醇合酶（linalool synthase）基因的克隆  26-31
    2.2.4 芳樟醇合酶基因表达载体的构建  31-32
    2.2.5 Llis 基因在大肠杆菌BL21 中的表达  32-33
    2.2.6 农杆菌介导烟草的遗传转化  33-34
    2.2.7 烟草再生植株的鉴定  34-36
3 结果与分析  36-46
  3.1 百合再生体系的探索  36-37
    3.1.1 百合诱导愈伤分化培养基的确定  36-37
  3.2 薰衣草LLIS 基因的克隆  37-43
    3.2.1 薰衣草Llis 基因的序列及功能  37-40
    3.2.2 Llis 基因组DNA 的克隆  40-42
    3.2.3 Southern 杂交分析  42
    3.2.4 原核表达  42-43
  3.3 芳樟醇合酶基因表达载体的构建  43
  3.4 烟草叶盘法转化及再生  43-44
  3.5 烟草再生植株的鉴定  44-46
    3.5.1 转基因烟草再生植株的PCR 鉴定  44-45
    3.5.2 转基因烟草的Northern Blotting 鉴定  45-46
4 讨论  46-48
  4.1 植物材料培养中存在的问题  46-47
  4.2 载体构建中存在的问题  47
  4.3 获得全长CDNA 中存在的问题  47
  4.4 PCR 中存在的问题  47-48
  4.5 核酸提取中应注意的问题  48
    4.5.1 RNA 提取中应注意的问题  48
    4.5.2 DNA 提取中应注意的问题  48
5 结论  48-50
致谢  50-51
参考文献  51-58
作者简介  58-59
附录  59

薰衣草芳樟醇合成酶的基因克隆、功能鉴定及转基因技术的研究

内容摘要

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