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保康柴胡的5s-rDNA间隔序列分析及品质研究

作　者: 熊梦晓
导　师: 黄必胜；胡继鹰
学　校: 湖北中医学院
专　业: 生药学
关键词: 柴胡柴胡皂苷 RP-HPLC PCR 5s-rDNA间隔区
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

柴胡是一种常用中药，也是多种中成药的主要原料药材，在中国应用已有2000多年的历史。2005版《中华人民共和国药典》记载柴胡的来源为伞形科植物柴胡（Bupleurum chinense DC．）、狭叶柴胡（Bupleurum scorzonerifolium Wild．）的干燥根。但在实际应用中，柴胡的商品来源非常复杂，柴胡属植物的绝大部分种类在产地均作柴胡药用，即使已被证明具有毒性的大叶柴胡也不例外。这成为中药柴胡使用品种混乱，柴胡及其制品质量不稳定的主要原因。目前柴胡用药和出口需求量大，使其野生资源日益枯竭。为满足需求量不断扩大的中药柴胡市场，近年来，柴胡人工种植在我国许多地区得到很大的发展。“保康柴胡”是以湖北省保康县的地名命名，为产地名称，其实际物种经鉴定为北柴胡。湖北保康盛产柴胡，有丰富的野生资源，又是优质地道药材柴胡的主要栽培生产地区。近几年来，保康地区人工种植柴胡面积不断增加。经调查发现，当地除GAP推荐的北柴胡外，还有少量的南柴胡和竹叶柴胡品种，加上药农多为自由种植，缺乏规范的管理和准确的种质鉴定，导致栽培用种不确切，药材品质参差不齐。作者通过高效液相色谱法（HPLC法）测定6个不同地区柴胡主要有效成分柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量，判断柴胡品种是否优良；再提取6个柴胡样品的总DNA，进行5s-rDNA间隔序列的PCR扩增和测序，研究了其遗传多样性。对我省柴胡GAP工作的品种质量鉴定和引种生产具有理论和实际意义。一、柴胡皂苷a、d的含量测定采用HPLC法对6个样品中的柴胡皂苷a、d进行了含量测定。对HPLC的各项参数进行了比较，最终确定使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；乙腈-水（40∶60）为流动相，流速为1.0mL·min^-1；检测波长为204nm；柱温为30℃。对其进行了方法学考察，平均回收率分别为99.29％、99.44％，RSD分别为0.73％、0.82％。结果证明所用方法准确可靠，可用于柴胡中柴胡皂苷a、d的含量测定。同时得出结果：湖北保康GAP示范基地所栽培的北柴胡品种与河南肖店栽培种北柴胡品质更佳，马桥安家湾和马桥董家沟村与马桥安家湾栽培种三岛柴胡的柴胡皂苷a、d含量相近。栽培种北柴胡的柴胡皂苷a、d的含量明显高于野生北柴胡。二、5s-rDNA间隔序列分析实验采用试剂盒法提取6个样品叶片的总DNA，对PCR的各项参数进行了一系列的比较和探索，包括DNA的提取方法、Taq酶的用量、dNTP的浓度、PCR反应等条件的优化，建立了优化反应体系，并且利用PCR产物直接测序，得到其5s-rDNA间隔序列。对这些序列进行了分析和比较，构建了聚类系统树。结果如下：6种柴胡样品的5s-rDNA间隔序列具有相似的碱基序列，6种近似的5s-rDNA间隔序列长度范围为270～321bp，G+C％含量为30.7～36.5％，应用Mega 3.0软件进行序列分析，得到遗传关系聚类图和样品相关系数，表明了不同产地柴胡间亲缘关系的远近。样品相关系数范围在1～17.25之间，种间5s-rDNA间隔序列差异大于种内，道地药材之间的遗传距离较小，影响各样品遗传距离的主要因素可能是柴胡基因型的不同。实验还发现，柴胡皂苷a、d的含量与5s-rDNA间隔区DNA序列变异一致，基因的差异很有可能是药材道地性的因素之一。关于道地性与基因的变化与环境的相关性还需进一步研究。

全文目录

中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
一、前言  9-11
二、实验研究  11-39
  第一部分柴胡皂苷a、d的含量测定  11-22
    1.仪器与试药  11-12
    2.实验方法  12-14
    3.供试溶液的制备和色谱条件的确定  14-15
    4.方法学考察  15-18
    5.结果与分析  18-20
    6.讨论  20-22
  第二部分柴胡5s-rDNA间隔序列分析  22-39
    1.仪器与试药  22-23
    2.实验方法  23-24
    3.结果与分析  24-28
    4.讨论  28-39
三、结论  39-40
四、我国药用柴胡的研究概况  40-49
参考文献  49-54
致谢  54-55
附件Ⅰ  55-56
附件Ⅱ  56

保康柴胡的5s-rDNA间隔序列分析及品质研究

内容摘要

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