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猪带绦虫45W-4B基因在大肠杆菌和家蚕中的表达及45W蛋白结构和功能的初步研究

作　者: 余招锋
导　师: 于三科；才学鹏；张志芳
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 猪带绦虫４５Ｗ基因ｐＥＴ－２８ａｐＶＬ１３９３表达
分类号: S852.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

猪带绦虫４５Ｗ基因家族是由一群结构和功能相似的基因组成的。４５Ｗ基因在反式剪接作用下产生Ａ、Ｂ和Ｃ三型转录本，其中Ａ型转录本是由外显子Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组成；Ｂ型转录本由Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ组成；Ｃ型转录本由Ⅰ和Ⅳ组成，在不同的转录本中的同一外显子有高度的同源性，也存在变异。　４５Ｗ基因已被认为是预防猪囊尾蚴病的基因工程疫苗侯选基因之一。本试验成功地从六钩蚴中克隆到４Ｂ基因。通过对４Ｂ基因序列的比较，发现４Ｂ基因是４５Ｗ基因中较为特殊的一个基因，该基因与４５Ｗ其他相关基因之间变异范围为１７．８％－２０．６％，但该基因在不同虫株间和不同克隆间高度保守。为了研究４Ｂ蛋白的结构和功能，并为研制和开发有效的猪带绦虫基因工程疫苗打下基础，本研究将４Ｂ基因及其３′－端的剪切片段克隆到ｐＥＴ－２８ａ载体中，并在大肠杆菌ＢＬ２１中成功地表达，与预期分子大小一致，为１８　ｋＤａ，经Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测，表达的重组蛋白能被猪囊尾蚴病人血清识别，为开发高效猪囊尾蚴基因工程疫苗打下了基础。　４５Ｗ基因的这独特的交替剪接形式引起了寄生虫学家们的广泛兴趣。为了研究４Ｂ蛋白在猪囊尾蚴组织中的结构和功能，试验中利用大肠杆菌表达系统表达的４Ｂ重组蛋白，分子量约为１８　ｋＤａ，腹腔注射免疫小白鼠，经两次免疫后，采血，并用该血清与猪囊尾蚴组织匀浆蛋白做免疫印迹，发现在５０　ｋＤａ处有一明显的印迹条带，而１８　ｋＤａ处没有。表明在猪囊尾蚴组织蛋白中４５Ｗ蛋白各型蛋白可能以同型或异型寡聚体形式存在。用计算机软件分析发现４Ｂ蛋白的抗原性很好，用蛋白质结构数据库　（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｓｅ，　ＰＤＢ）比较，发现４Ｂ蛋白（包括４５Ｗ其他型）存在纤连蛋白（Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ，　ＦＮ）结构域。４５Ｗ蛋白寡聚体形式组成与纤链蛋白的组织构成十分相似，推测４５Ｗ蛋白与猪囊尾蚴囊壁的形成有关。　家蚕表达系统通过将外源目的基因插入家蚕核多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）多角体启动子（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）的下游，外源基因利用多角体启动子进行转录表达，并分泌到细胞外，从而在细胞上清获得重组目的蛋白。家蚕表达系统（ｓｉｌｋｗｏｒｍ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｓｙｓｔｅｍ，　ＢＥＶＳ）表达的目的蛋白能够进行正确的加工、修饰，使目的蛋白更接近于天然蛋白。同时家蚕细胞能识别哺乳动物的分泌蛋白的信号肽序列。４Ｂ基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９３中，通过与家蚕杆状病毒（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ，　ＢｍＮＰＶ）在家蚕Ｂｍ细胞中共转染，重组到ＢｍＮＰＶ中，通过筛选纯化，获得重组病毒。重组病毒感染家蚕细胞和５龄家蚕，表达４Ｂ蛋白，分子量约为１６　ｋＤａ，　与预测的大小相吻合。并用Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ<WP=6>鉴定该重组蛋白能识别猪囊虫病人（猪）阳性血清。４Ｂ基因在家蚕细胞中的表达对进一步研究４５Ｗ基因的结构功能，并开发出更可行、方便的基因工程疫苗打下基础。

全文目录

文献综述  12-26
  第一章猪囊尾蚴与猪囊尾蚴病  12-26
    1 囊尾蚴病流行特点及现状  12-13
    2 猪囊尾蚴生物学  13-15
      2.1 猪囊尾蚴普通生物学  13-14
      2.2 猪囊尾蚴分子生物学  14-15
    3 囊尾蚴病的的诊断与检测  15-19
      3.1 囊尾蚴病的的免疫诊断技术  15-17
      3.2 猪囊尾蚴病的免疫检测和预防用抗原  17-19
    4 口服疫苗研究进展  19-26
      4.1 转基因植物生产的口服疫苗  19-21
      4.2 沙门氏菌减毒株携带的口服疫苗  21-23
      4.3 转基因动物生产的口服疫苗  23-26
试验研究  26-63
  第二章一般材料与常规方法  26-38
    1 一般材料  26-31
      1.1 菌种和质粒  26
      1.2 病毒细胞和家蚕  26
      1.3 工具酶和试剂盒  26
      1.4 其它主要试剂  26
      1.5 主要仪器  26-27
      1.6 LB 培养基  27
      1.7 昆虫细胞培养液的配制  27
      1.8 常用溶液和缓冲液  27-28
      1.9 碱法质粒抽提液的配制  28-29
      1.10 SDS-PAGE 电泳试剂的配制  29-30
      1.11 免疫印迹材料与试剂  30-31
    2 分子生物学常规方法  31-34
      2.1 碱法少量快速抽提质粒 DNA  31
      2.2 碱法大量制备质粒 DNA  31
      2.3 限制性内切酶反应  31-32
      2.4 DNA 片段的分离与回收  32
      2.5 DNA 的连接  32
      2.6 质粒 DNA 的转化  32-33
      2.7 重组质粒的鉴定  33
      2.8 家蚕的饲养  33
      2.9 SDS-PAGE 电泳  33
      2.10 免疫印迹  33-34
    3 细胞和病毒常规操作方法  34-38
      3.1 细胞的复苏  34
      3.2 细胞的传代  34
      3.3 细胞的冻存  34-35
      3.4 细胞计数  35
      3.5 病毒滴度的测定  35-36
      3.6 病毒稀释液的配制  36
      3.7 病毒 DNA 的提取  36-37
      3.8 共转染  37
      3.9 重组病毒的筛选纯化和扩增  37-38
  第三章猪带绦虫 45W-4B基因的克隆及序列分析  38-45
    1 材料和方法  38-40
      1.1 材料  38
      1.2 猪带绦虫六钩蚴 mRNA的提取  38
      1.3 cDNA 第一链的合成  38-39
      1.4 4B 基因的 PCR 扩增  39-40
      1.5 4B 基因的克隆  40
      1.6 4B 基因的同源性分析  40
    2 结果  40-44
      2.1 4B 基因的克隆  40-41
      2.2 4B 基因序列的比较分析  41-44
    3 结论  44-45
  第四章猪带绦虫 45W-4B基因在大肠杆菌中的表达  45-52
    1 材料与实验方法  46-48
      1.1 材料  46
      1.2 实验方法  46-48
    2 实验结果  48-50
      2.1 重组载体的构建  48
      2.2 pET-28a-4B-R1/R2 重组质粒在 BL21 中的表达蛋白质的 SDS-PAGE  48-49
      2.3 表达蛋白质免疫印迹检测  49-50
    3 讨论  50-51
    4 结论  51-52
  第五章 45W 蛋白结构和功能的初步分析  52-57
    1 试验材料和方法  52-54
      1.1 试验动物和材料  52
      1.2 实验方法  52-54
    2 实验结果  54-55
      2.1 4B 基因的计算机分析  54
      2.2 大肠杆菌表达目的蛋白的 SDS-PAGE  54
      2.3 猪囊尾蚴组织匀浆蛋白的免疫印迹  54-55
    3 讨论  55-56
    4 结论  56-57
  第六章 45W-4B基因在家蚕中的表达  57-63
    1 材料与实验方法  58-59
      1.1 材料  58
      1.2 方法  58-59
    2 实验结果  59-62
      2.1 重组转移载体的构建  59
      2.2 重组病毒的 PCR 鉴定  59-60
      2.3 4B 重组蛋白的 SDS-PAGE电泳  60-62
      2.4 蛋白质免疫印迹检测  62
    3 讨论  62
    4 结论  62-63
参考文献  63-71
附录  71-72
致谢  72-73
作者简介  73-74
英文缩略表  74-75

猪带绦虫45W-4B基因在大肠杆菌和家蚕中的表达及45W蛋白结构和功能的初步研究

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