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透明颤菌血红蛋白基因在苏云金杆菌的克隆与表达

作　者: 周艳芬
导　师: 赵晓瑜
学　校: 河北大学
专　业: 植物学
关键词: 苏云金杆菌 大肠杆菌 嗒白基因 克隆与表达 原生质电转化
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要


微生物体中存在着控制和应答溶氧水平的敏感体系，该体系通过改变微生物的生长状态维持稳定的溶氧水平。已知透明颤菌在贫氧环境中能大量合成血红蛋白(VHb)以适应其在贫氧环境中生存，目前该蛋白的基因已经被克隆到多种异源生物体内，并促进了异源生物体在微氧条件下的生长和蛋白质的合成能力。本研究是将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)克隆到苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)HBF-1和大肠杆菌中，研究该基因对苏云金杆菌和大肠杆菌生长的促进作用。 为了使vgb基因在苏云金杆菌中高效表达，本研究采用革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌的穿梭质粒pMK4作为载体，果聚蔗糖酶基因(sacB)作为启动子，构建了含有果聚糖酶基因sacB启动子和vgb基因的重组质粒pMK-SV。 创造性地采用原生质体电转化的方法，将pMK-SV转入苏云金杆菌中，经影印筛选得到转化子Bt4。对Bt4诱导表达，与原菌株相比Bt4的生长量增加了20.2％。 为了将含有天然启动子的vgb基因克隆到pMK4中，本研究根据Genebank中vgb基因的编码序列设计引物，PCR扩增，得到470bp的结构基因，将其克隆到大肠杆菌表达载体pBV221中，构建成重组表达载体pBV-V。经温度诱导，得到了15.7kD的VHb蛋白。 合成vgb基因的天然启动子，与vgb结构基因拼接，构建重组质粒pUC-LV，通过诱导表达，重组子的菌密度增加了157％，得到了具有生理活性的15.7kD的VHb蛋白。

全文目录


第1章 前言  8-17
  1.1 苏云金杆菌生物杀虫剂概述  8-9
    1.1.1 苏云金杆菌  8-9
    1.1.2 金龟子类幼虫及其防治  9
  1.2 氧气在微生物发酵中的作用  9-10
  1.3 透明颤菌血红蛋白基因(vgb)及其研究进展  10-15
    1.3.1 透明颤菌的概述  10-11
    1.3.2 透明颤菌血红蛋白的结构  11-12
    1.3.3 透明颤菌血红蛋白的作用机制和功能  12-13
    1.3.4 透明颤菌血红蛋白与细胞膜的相互作用  13-14
    1.3.5 透明颤菌血红蛋白的基因调控  14
    1.3.6 透明颤菌血红蛋白的应用  14-15
  1.4 革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌穿梭质粒  15-16
    1.4.1 穿梭质粒pMK4  15-16
    1.4.2 果聚蔗糖酶基因启动子  16
  1.5 本研究的目的和意义  16-17
第2章 实验材料与方法  17-25
  2.1 实验材料  17-19
    2.1.1 菌种与质粒  17
    2.1.2 培养基  17
    2.1.3 抗生素  17
    2.1.4 主要用酶  17-18
    2.1.5 主要仪器  18
    2.1.6 溶液与试剂  18-19
  2.2 实验方法  19-25
    2.2.1 质粒载体的制备  19-20
    2.2.2 PCR扩增目的片段  20
    2.2.3 载体DNA与片段的连接  20-21
    2.2.4 重组质粒转化大肠杆菌DH5α  21
    2.2.5 苏云金杆菌的转化  21-23
    2.2.6 透明颤菌血红蛋白基因在大肠杆菌中的表达  23-24
    2.2.7 CO差光谱法测定血红蛋白的活性  24
    2.2.8 苏云金杆菌重组子的诱导表达  24-25
第3章 结果与讨论  25-43
  3.1 vgb基因(含sacB启动子)在苏云金杆菌中的克隆与表达  25-30
    3.1.1 革兰氏阴性菌与阳性菌穿梭质粒pMK-SV的构建  25-27
    3.1.2 pMK-SV转化苏云金杆菌  27-30
  3.2 vgb基因(含天然启动子)在苏云金杆菌中的克隆与表达  30-43
    3.2.1 pUC19-800质粒的构建  30-33
    3.2.2 pUC-V质粒的构建  33-35
    3.2.3 pBV-V的构建  35-37
    3.2.4 pUC-LV质粒的构建  37-42
    3.2.5 构建含有天然启动子的穿梭质粒pMK-LV  42-43
第4章 结论  43-44
下一步工作建议  44-45
参考文献  45-50
本研究期间发表的相关论文  50-51
致谢  51

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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