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恶性疟原虫乳酸脱氢酶的表达、纯化、单克隆抗体的制备及鉴定

作　者: 李莉
导　师: 李明；朱佐江
学　校: 第一军医大学
专　业: 免疫学
关键词: 恶性疟原虫乳酸脱氢酶表达纯化单克隆抗体免疫胶体金层析
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

疟疾是一种严重危害人类健康的虫媒性传染病，尤其在热带、亚热带地区流行广泛。据WHO统计，全球每年有近3-5亿人感染疟疾，其中约300万人死亡。在我国也有24个省、市及自治区不同程度地存在疟疾流行。据我国卫生部疟疾委员会最新资料显示，南部地区如云南、广西、海南等省疟疾发病率较往年都有不同程度的提高，因此，疟疾的防治始终是寄生虫病研究的重点之一。疟疾的诊断是疟疾防治工作中的一个重要环节，目前疟疾诊断技术正朝着简便、快速、灵敏、特异及结果易于判定的方向发展，而以单抗为基础的Dipstick免疫层析技术具有以上优点，应用前景广泛。本研究旨在利用疟原虫的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)为诊断靶抗原，通过对该蛋白进行克隆、表达，制备单抗，并筛选、配对建立反应模式等系列研究，开发用于疟疾快速诊断的免疫层析检测试剂盒。研究中，首先将恶性疟原虫的LDH(Plasmodium falciparum lactate dehydrogenase, LDHpf)基因克隆至pET-23a(+)表达载体中，构建pET23-LDH重组质粒。重组质粒在BL21中得到高效表达，SDS-PAGE显示表达蛋白分子量约为33KDa，与先前报道的疟原虫LDH分子量理论值(31-36Kda)基本符合。表达产物冰浴超声破菌，发现目的蛋白大部分溶于上清中，为可溶性表达，密度扫描显示目的蛋白占菌体总蛋白的41.2％。采用Q-Sepharose High Performance阴离子交换树脂柱层析对pET23-LDH重组蛋白进行纯化，SDS-PAGE电泳经凝胶光密度图象分析系统检测主蛋白纯度可达89.1％，浓度为400μg／ml。用纯化的重组蛋白免疫BALB／c小鼠制备免疫血清，ELISA结果显示免疫小鼠血清与pET23-LDH表达产物出现明显反应，而对空载体PET一23a表达产物无反应。westernblot分析表明特异性区带出现在33kDa处，而空载体诱导后表达的产物无区带出现。进一步用该免疫血清与恶性疟原虫和间日疟原虫反应，western b10t结果表明免疫血清能识别恶性疟原虫和间日疟原虫33KDa处虫源蛋白，而与未感染的红细胞不发生交叉反应，提示pET23一LDH重组蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。以纯化后的LDH重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SPZ/0进行融合，融合细胞用队T培养基作选择性培养。采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株，获得n株能分泌高效价和高特异性的抗LDH重组蛋白单抗的杂交瘤细胞株。工g类与亚类鉴定结果为2Bll、3C9、3DIO、6D3、7D2、IE7、6G7、IC6、2D7重链类型为1 9 Gl亚类，轻链为K型;2F12重链类型为1 9 GZ亚类，轻链为K型;2C6重链类型为1 gGI亚类，轻链为人型。n株单抗培养上清的ELISA效价为1:100~1:400，腹水效价为l:6400一1:51200。从而可为恶性疟原虫免疫胶体金快速诊断试剂盒的研制提供抗体。利用饱和硫酸按纯化后的n株单抗，建立了同时诊断恶性疟原虫和间日疟原虫的G工以法。两次筛选的结果显示以3C9包被抗体，IE7标记抗体为GICA较适反应模式。以此反应模式对重组抗原Ing/m1，sng/ml，10ng/ml，100 ng/ml，500 ng/ml进行测定，其最低检测量为5 ng/ml，并且结果呈现较好的梯度，说明反应线颜色的深浅与抗原含量成正比。用制备的免疫层析条对30例恶性疟病人血样、40例间日疟病人血样及100例正常人血样进行检测，恶性疟的敏感性为83.3%，间日疟敏感性为57.5%，特异性均为98%。虽然在敏感性较国外试剂盒还有差别，但提示我们LDHPf为检测靶抗原是可行的，如在单抗的制备、GIGC工艺上做进一步完善，开发出同时诊断恶性疟原虫和间日疟原虫的试剂盒指日可待。

全文目录

缩略词  6-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-12
前言  12-15
第一部分恶性疟原虫乳酸脱氢酶的表达、纯化及免疫活性测定  15-33
  一、材料  15-16
  二、实验方法  16-22
    (一) pET23-LDH重组质粒的构建  16-19
      1 、小量碱法提取质粒DNA  16-17
      2 、感受态细胞的制备  17
      3 、质粒酶切、目标DNA片段的回收及连接  17-18
      4 、重组克隆的筛选及鉴定  18-19
      5 、 LDHpf基因序列测定及同源性分析  19
    (二) pET23-LDH重组蛋白表达  19
      1 、 pET23-LDH的诱导表达  19
      2 、表达产物可溶性分析  19
    (三) 表达产物的纯化  19-20
    (四) 表达产物的免疫学鉴定  20-22
  结果  22-30
    一、重组克隆的筛选与鉴定  22-23
    二、序列测定及同源性分析  23-27
    三、重组质粒的表达  27-28
    四、表达产物的纯化  28
    五、表达产物免疫学分析  28-30
  讨论  30-32
  小结  32-33
第二部分单隆抗体的制备及鉴定  33-41
  一、材料  33-34
  二、实验方法  34-37
    (一) 抗原选择  34
    (二) 动物免疫  34
    (三) 细胞融合  34-35
    (四) 阳性克隆的筛选  35
    (五) 杂交瘤细胞的克隆化  35-36
    (六) 单克隆抗体的生产  36
    (七) 单克隆抗体的Ig类与亚类鉴定  36
    (八) 效价测定  36-37
  结果  37-39
    一、杂交瘤细胞株的建立  37
    二、单克隆抗体的Ig类与亚类鉴定  37
    三、效价测定  37-39
  讨论  39-40
  小结  40-41
第三部分免疫胶体金层析法检测LDHp  41-51
  一、材料  41
  二、实验方法  41-44
    (一) 单抗的纯化  41
    (二) 胶体金的制备  41-42
    (三) 胶体金标记物制备  42
    (四) 标记胶体金聚酯膜的制备  42
    (五) 单克隆抗体及羊抗鼠IgG的包被  42
    (六) 试纸条组装  42
    (七) 测试方法  42-44
  结果  44-47
    一、饱和硫酸铵法纯化抗体  44-45
    二、 GICA反应模式的建立  45
    三、灵敏度实验  45
      1 、最低检测量的测定  45
      2 、疟疾血样的检测  45
    四、特异性实验  45-46
    五、批内重复性和批间重复性  46
    六、稳定性实验  46-47
  讨论  47-50
  小结  50-51
总结  51-52
参考文献  52-57
致谢  57-58
综述  58-70
附录: 论文发表情况  70

恶性疟原虫乳酸脱氢酶的表达、纯化、单克隆抗体的制备及鉴定

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