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BDNF，Sema3A在大鼠局灶性脑缺血的表达及葛根素保护作用的实验研究

作　者: 李贯绯
导　师: 刘群
学　校: 吉林大学
专　业: 神经病学
关键词: 脑缺血脑源性神经营养因子 Sema3A 葛根素免疫组织化学
分类号: R743.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

脑缺血后，多种神经营养因子（Neurotrophic factors，NTFs）及神经生长抑制因子（neuron growth inhibitors，NGI）的表达上调，对缺血性神经元损伤修复和再生起着至关重要的作用。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）属神经生长因子家族，又称神经营养因子。离体及体内实验研究均证实BDNF具有刺激和促进发育中的交感、感觉和运动神经元的存活、分化和增殖的作用,并可以促进损伤细胞的修复。国外文献报道，BDNF在脑缺血后神经元损伤和修复过程中也发挥重要作用。研究还发现缺血时间越长，损伤越重，BDNF mRNA表达越明显。以往认为CNS损伤后难以再生是由于缺乏再生的NTFs，但是大量的实验研究表明，中枢神经损伤后，单纯给予NTFs并不能取得明显的再生效果。这些结果高度提示，在CNS中，还存在着神经生长抑制性因子，它们在轴突的寻路和致靶（targeting）过程中起着关键作用，同时也控制着中枢神经的再生。（Semaphorin3A Sema3A）作为一种神经生长抑制因子，可以特异性的引起轴突生长锥（growth cone）萎缩，并抑制轴突延伸，与神经元再生和死亡有关。Sema3A随着神经系统发育成熟，在成年动物中表达水平明显下降甚至消失。但Pasterkamp等发现，损伤等外来因素能够诱导它们表达增加或重新表达，此时具有阻止成年动物神经再生的活性。纵观前期研究，提示我们可以通过给予BDNF促进损伤神经修复或给予Sema3A抑制因子来<WP=38>阻断Sema3A对神经再生的抑制作用，从而促进损伤后神经功能的恢复，为解决中枢神经的损伤修复再生问题开辟一条新的途径。然而，由于BDNF和Sema3A为蛋白质，通过消化道给药会被降解，又不易通过血脑屏障及其使用过程中安全性问题，限制了其使用。葛根素（puerarin）具有明确的扩张冠状血管、脑血管和改善微循环作用，然而葛根素对脑缺血后BDNF、Sema3A表达的影响未见报道，本研究拟用大鼠MCAO法建立缺血模型，采用免疫组织化学方法观察局灶性脑缺血后大鼠脑内BDNF、Sema3A的表达，并观察应用葛根素后大鼠脑内BDNF、Sema3A表达的变化来研究其对缺血性脑损伤的神经元保护作用。实验选用雄性Wistar大鼠，鼠龄3~4个月,体重250~300g，随机分成4组，正常对照组、假手术组、缺血组（缺血后每天给以等量生理盐水，腹腔注射）、治疗组（缺血后每天给以葛根素0.1mg/kg一次,腹腔注射）。缺血组和治疗组又根据缺血时间不同，分别分为缺血6h、1d、3d、5d、7d、14d亚组。采用线栓法建立大鼠永久大脑中动脉闭塞（MACO）模型，观察葛根素对其神经症状、脑组织形态学变化的影响，应用免疫组织化学方法观察BDNF和Sema3A在局灶性脑缺血后不同时间阳性神经元的动态改变。结果显示，葛根素治疗组缺血性脑卒中动物的神经缺失症状显著减轻，缺血区的病理组织学变化较缺血组改善。免疫组化显示，正常对照组和假手术组BDNF和Sema3A阳性神经元呈少量表达，缺血组和治疗组BDNF和Sema3A阳性神经元自缺血6h<WP=39>开始增多，至1d达高峰，缺血组至3d达正常对照组水平。治疗组BDNF阳性神经元较缺血组增多，治疗1d组BDNF免疫阳性细胞数较正常对照组高约218.55%（P<0.01），治疗组至7d达到对照组水平。治疗组Sema3A阳性神经元较缺血组减少。统计学分析显示正常对照组与假手术组无明显差异（P>0.05），治疗组与缺血组比较有显著差异（P<0.05）。 BDNF可以维持感觉神经元、运动神经元、中脑多巴胺能神经元及胆碱能神经元的存活，本研究结果提示：脑缺血后内源性BDNF可以出现短暂性表达增高，提示其可能在脑缺血损伤过程中发挥潜在的保护作用。我们推测，脑缺血时，谷氨酸释放、N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体激活及Ca2+内流引起BDNF水平升高，其功能意义可能有利于受损神经元的修复。免疫组织化学方法发现齿状回BDNF免疫阳性神经元密度较高，实验表明齿状回神经元比其他区域的神经元更能对抗缺血引起的损伤，而对缺血敏感的CA1区很难检测到BDNF免疫阳性神经元的存在，因此提示BDNF具有对抗脑缺血的作用。然而，总的看来，脑缺血后内源性BDNF的表达增加水平偏低，且持续时间亦较短，单纯内源性的BDNF的上调不足以防治神经细胞死亡，而且，由于BDNF是大分子蛋白质，不易通过血脑屏障及其存在快速降解等问题，限制了其使用。目前多采用将BDNF直接注入侧脑室或通过基因工程技术植入脑内表达来提高中枢BDNF的供给，其主要缺点是需采取侵害性给药途径。如何将BDNF安全、有效、长期送到病变部位是目前脑缺血治疗需要解决的方向性问题。因此，寻求一条能促进BDNF内源性表达的途径尤为重要。通过本实<WP=40>验，我们发现，应用葛根素后BDNF的表达时程延长，阳性神经元数量增多，提示葛根素根素作为一种小分子药物，可通过血脑屏障，可能通过促进BDNF的表达起到神经保护作用。 Sema3A可以特异性的引起轴突生长锥（growth cone）萎缩，阻止神经突起的分叉，影响神经突起的方向，阻止轴突进入一定的靶区，阻止轴突终末的形成，并抑制轴突延伸。因此，它在CNS的持续表达抑制了损伤后Sema3A敏感性神经元的再生。本研究结果显示，在正常对照组和假手术组Sema3A仅有微?

全文目录

英文缩写词  6-7
提要  7-8
前言  8-11
材料与方法  11-16
结果  16-21
讨论  21-29
结论  29-30
参考文献  30-34
附图  34-37
中文摘要  37-42
英文摘要  42-46
致谢  46-47

BDNF，Sema3A在大鼠局灶性脑缺血的表达及葛根素保护作用的实验研究

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