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嗅鞘细胞生物学特性研究及其移植修复急性脊髓损伤的长期实验观察

作　者: 史建国
导　师: 孙天胜；戴刚
学　校: 第三军医大学
专　业: 骨科学
关键词: 嗅鞘细胞脊髓神经元细胞培养脊髓损伤细胞移植神经再生
分类号: R651.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

因创伤所致急性SCI的发病率目前呈逐年上升趋势，严重的SCI所致的截瘫和四肢瘫不仅使患者本人及其家庭产生巨大痛苦，而且带来许多严重的社会问题。因此，损伤后脊髓再生和功能重建一直是医学界和社会密切关注的重要问题。近年研究证实，组织或细胞移植可替代受损变性的神经元，或者改善神经损伤的微环境，引导和挖掘受损神经或变性神经再生的潜能，从而达到修复治疗神经损伤的目的。其中OECs是一种可以明显促进神经再生的移植细胞，修复效果较为理想，然而OECs移植对SCI的修复作用研究较少，且作用机制尚不清楚，缺少远期效果的实验观察。本研究旨在通过体外培养OECs的生物学特性研究，观测体外OECs与脊髓神经元嵌套联合培养过程中,OECs对脊髓神经元的存活和突起生长的影响及其可能的机制；并探索研究体内神经细胞相互作用的理想的体外模型。此外，通过纯化培养OECs异体移植修复急性SCI实验研究，观察移植OECs对急性SCI神经纤维再生及功能恢复的远期效果；并探讨其作用方式与途径。一、体外培养OECs的生物学特性研究采用新生Wistar大鼠OECs及同种胎鼠脊髓神经元的原代纯化培养及其嵌套联合培养方法，并通过培养细胞生长曲线绘制、GFAP及P75免疫细胞化学双染、抗神经丝NF-200免疫细胞化学染色、脊髓神经元存活指数与突起长度测量、OECs纯化培养液蛋白质电泳观测进行的体外培养OECs生物学特性研究所得实验结果如下：1、体外原代纯化培养嗅鞘细胞及脊髓神经元的形态变化、生长特点及其鉴定OECs于24小时内完全贴壁；培养第4天，细胞体呈典型的双极或三极，突起较长；培养第10天，细胞融合成片，胞体仍呈典型的双极或三极，突起进一步加长。脊髓神经元在24小时内完全贴壁，且聚集成簇；各簇细胞大多数呈圆形，立体感较强；每簇细胞数不等，突起向周围长出，相临细胞簇之间无纤维相连。培养第6天，各簇神经元胞体增大，形态各异，突起不断伸长，其分支相互交叉呈网络状。原代纯化培养OECs时，细胞数量略有减少；培养第2天，细胞数逐渐快速增加，培养至第6天时其增长速度减缓。原代纯化培养OECs的 GFAP和P75免疫组织化学双染均呈双阳性，其纯度达90%以上。2、OECs对脊髓神经元存活指数和突起生长的影响 OECs与脊髓神经元联合培养第6天，其脊髓神经元形态规则，数目较多；而同期单纯培养脊髓神经元形态不一，数目较少，突起断裂。联合培养脊髓神经元存活指数高于同期单纯培养脊髓神经元的存活指数，两组比较有统计学差异（P〈0.05）。联合培养第24小时，脊髓神经元平均总突起长度和平均最长突起长度均明显高于同期单纯脊髓神经元培养组，两组比较有统计学显著差异( P<0.01 )。3、OECs纯化培养液蛋白质检测结果 OECs纯化培养液SDS-PAGE电泳后，可见多条蛋白电泳条带；其中分子量17-33Kd之间可见2条蛋白电泳条带，分子量48Kd以上可见多条条蛋白电泳条带。上述结果表明，体外原代纯化培养的OECs及脊髓神经元具有其特有的形态变化、生长特点。体外OECs与脊髓神经元嵌套联合培养过程中,OECs对脊髓神经元的存活和突起生长具有明显的促进作用；这种促进作用可能是通过OECs所分泌的神经营养因子和细胞黏附因子等实现的；细胞-细胞嵌套联合培养是研究体内神经细胞相互作用的理想的体外模型。二、嗅鞘细胞异体移植修复急性脊髓损伤的长期实验观察在进行体外培养OECs生物学特性研究的基础上，以恢复截瘫大鼠的神经功能为出发点，选用大鼠脊髓完全损伤模型，实验分OECs移植组、DMEM注射组及Sham组，通<WP=8>过术后动物体重变化、EP检测、BBB神经功能评分、FG逆行示踪、组织病理学与超微结构观察，分析和评价纯化培养OECs异体移植对急性SCI修复作用的实验结果如下：1、移植OECs在受体内的存活与迁移术后24周，于OECs移植组细胞注射位点及其邻近区域均可见较多圆形荧光物质，即Hoechst标记的存活OECs。2、纯化培养OECs移植对急性SCI功能恢复的有限促进作用术后OECs移植组与DMEM注射组动物均出现体重减轻，术后4周降至最低；此后，OECs移植组动物体重逐渐增加，而DMEM注射组动物体重增加不明显；术后24周，OECs移植组动物体重与DMEM注射组比较有统计学差异（P<O.05）；观察期内两组动物均未恢复到术前重量。术后5周内，OECs移植组与DMEM注射组动物BBB评分均为0分；术后第6周， OECs移植组动物BBB评分分值逐渐增加（与DMEM注射组比较有显著差异，P＜0.01），16周以后BBB评分分值无明显增加（P>0.05）。术后12周时，OECs移植组动物可引出运动EP，而DMEM注射组动物未引出运动EP；术后 24周，OECs移植组与DMEM注射组动物均可引出运动EP，而其P1潜伏期与脊髓损伤前及同期Sham组比较均仍明显延长(P值均〈0.01)。3、纯化培养OECs移植对急性SCI神经纤维再生的促进作用脊髓损伤区组织纵切面的HE染色观察可见，OECs移植组细胞数目较多，组织结构紊乱，基质纤维扭曲；DMEM注射组细胞数目较少，组织结构紊乱，纤维含量少且扭曲，可见大小不等的空洞形成。神经细胞FG逆行示踪标记镜下观察可见，脊髓示踪剂注射点内及附近组织充满呈金黄色荧光的FG

全文目录

英文缩略词一览表  4-5
英文摘要  5-7
中文摘要  7-9
前言  9-10
第一部分、嗅鞘细胞生物学特性研究  10-22
  前言  10
  材料与方法  10-13
  结果  13-16
  讨论  16-18
  结论  18-19
  参考文献  19-22
第二部分、嗅鞘细胞异体移植修复急性脊髓损伤的长期实验观察  22-35
  前言  22
  材料与方法  22-26
  结果  26-30
  讨论  30-32
  结论  32-33
  参考文献  33-35
全文结论  35-36
致谢  36-37
照片  37-49
文献综述：嗅鞘细胞与中枢神经再生  49-55
参考文献  55-57

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