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流行性乙型脑炎病毒E蛋白基因主要抗原域的原核表达及ELISA诊断试剂盒的研制

作　者: 杨耀武
导　师: 沈国顺；陈溥言
学　校: 沈阳农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 流行性乙型脑炎病毒 E蛋白基因反转录-聚合酶链反应表达抗原性间接酶联免疫吸附测定
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

流行性乙型脑炎(Epidemic Encephalitis B)是由日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV)引起的中枢神经系统的急性传染病。在动物中，猪对JEV的感染是最普遍的，血清学检测阳性率达90％以上，严重危害养猪业的快速、健康发展。本文利用E.coli原核表达系统对JEV主要结构基因E蛋白基因进行了高效表达，并利用表达产物初步建立了间接ELISA检测方法，为以后试剂盒的标准化和商品化奠定了基础。研究结果如下： 1．根据已发表的JEV SA14-14-2减毒株基因组序列，设计一对特异性引物，通过RT-PCR扩增出一条长1,131bp的基因片段，与预期大小相符，经序列测定和序列分析表明：该基因片段与GenBank收录的减毒株SA14-14-2序列同源性为100％，与强毒株SA14、标准强毒株JaOArS982、减毒株Beijing-1以及台湾TC、TL株碱基序列同源性分别为99.1％、98.2％、96.9％以及97.4％、96.9％。 2．扩增的基因片段编码371个氨基酸，与GenBank收录的减毒株SA14-14-2氨基酸序列同源性为100％，与强毒株SA14、标准强毒株JaOArS982、减毒株Beijing-1以及台湾TC、TL株氨基酸序列同源性分别为97.8％、97.6％、97.3％以及96.8％、97.3％，说明JEV不同毒株的E蛋白比较保守，并且通过抗原性比较发现，其抗原表位差异不大，说明本实验表达的蛋白具有通用性。 3．为验证JEV E基因在E.coli中表达的可行性及表达产物的抗原性，构建了原核表达载体pET-E，将pET-E转化入工程菌BL21(DE3)后，利用IPTG进行诱导获得高效表达，表达产物分子量为62.3kD，符合预期结果。对表达产物进行Western blotting分析，结果与JEV特异性猪抗血清呈现阳性反应，且无非特异性条带出现，证明表达产物抗原性较好。 4．将经超声波破碎的菌体，5,000g离心15min，收集上清和沉淀，分别取少量上清和沉淀行SDS-PAGE，结果上清仅有少许目的条带，而沉淀在62kD处出现一条明显的特异性蛋白条带，证明表达产物大部分以包涵体形式存在。然后按照His·Bind Purification Kit说明对包涵体进行纯化，取少量纯化产物行SDS-PAGE，结果在62 kD处出现一条清晰的特异性蛋白条带，杂蛋白很少，表明表达产物的纯化良好。中文摘要 5.按常规方法以OPD作为底物进行间接ELISA方阵发现:阳性血清梯度比较明显，说明所表达的蛋白抗原性比较好;在抗原作1:1，280倍稀释，阳性血清作1:320稀释时(OD=l .024)，与阴性对照(抗原和血清均作1:10稀释，OD=0.059，)比较，OD。阴值之比仍远大于2，说明该研究可行性良好。 6.按常规方法分别以OPD和TMB为底物，在二者抗原和血清同样的稀释度条件下(抗原从卜10开始稀释，共稀释11个梯度，终稀释度为1:10，240;血清均作1:200稀释)进行间接ELISA对照试验可以发现:二者的阳性血清反应均有明显的梯度，而阴性血清基本上均无反应，其中以TMB为底物时，适合目测和定性研究，但进行定量测定时，阳性OD值数据偏低，且梯度不如以OPD为底物时大，所以最后定为以OPD作为间接ELISA检测用底物。 7.通过进行ELISA方阵，将抗原稀释度定为1:1，500一l:3，000，血清稀释度定为l:200，阳性标准初步定为:OD。。血，>0.400，且OD。。.，/OD，!性血，>2。对送检的十几个猪场血清样品进行检测发现，依照上述标准，所测血清样品均呈JEV抗体阳性。大丰、溥阳等猪场有个别猪抗体水平明显高于或低于整体抗体水平，说明个别猪有野毒感染，但究竞是隐性感染还是已经发病，由于不知道送检样品的具体背景，所以尚无定论。其它猪场抗体水平比较均一，基本说明是接种疫苗产生的抗体。 8.通过westem blotting免疫转印和间接ELISA检测说明该研究用于猪流行性乙型脑炎的诊断和检测是可行的，并且目前的研究工作为以后试剂盒的标准化和商品化奠定了基础。

全文目录

摘要  7-9
前言  9-20
  一、流行性乙型脑炎概述  9
  二、流行性乙型脑炎病毒(JEV)的流行病学  9-11
  三、流行性乙型脑炎病毒的基因组结构与功能  11-13
  四、流行性乙型脑炎病毒的基因编码产物及其功能  13-16
  五、流行性乙型脑炎血清学及分子生物学诊断技术  16-20
猪流行性乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原域的基因克隆、测序与原核表达载体构建  20-47
  一、材料与方法  20-26
  二、结果  26-44
    (一) RT-PCR结果  26
    (二) 重组克隆载体的鉴定  26-27
    (三) 测序与序列分析  27-43
    (四) 原核表达载体pET-E的构建  43
    (五) 原核表达载体的鉴定  43-44
  三、讨论  44-46
  四、结论  46-47
猪流行性乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原域的原核表达与间接ELISA检测方法的初步建立  47-64
  一、材料与方法  47-52
  二、结果  52-59
    (一) 表达产物的SDS-PAGE  52
    (二) Western blotting结果  52-53
    (三) 利用SDS-PAGE检验表达产物的可溶性  53
    (四) His.Bind~(?) Purification Kit纯化后表达产物的SDS-PAGE  53-54
    (五) 间接ELISA方阵结果  54-55
    (六) 间接ELISA所用底物的对照比较  55-56
    (七) 间接ELISA检测方法的初步建立  56-59
  三、讨论  59-63
  四、结论  63-64
参考文献  64-69
英文摘要  69-71
全文总结  71-72
附录  72-74
致谢  74-75

流行性乙型脑炎病毒E蛋白基因主要抗原域的原核表达及ELISA诊断试剂盒的研制

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