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动脉粥样硬化过程中D-dimer和Nogo-B对巨噬细胞功能的影响

作　者: 熊青卉
导　师: 芮耀诚；杨鹏远
学　校: 第二军医大学
专　业: 药理学
关键词: 动脉粥样硬化氧化低密度脂蛋白巨噬细胞 D-dimer Nogo-B
分类号: R543
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

研究背景：动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是一种慢性的炎症反应,单核巨噬细胞在该病的发生发展中发挥重要作用：AS初期,单核细胞粘附于受损内皮细胞表面并迁移到内膜下分化为巨噬细胞,后者吞噬脂质形成泡沫细胞；泡沫细胞通过分泌促炎因子诱导斑块区的炎症反应进一步发生；AS后期,泡沫细胞坏死导致胞外脂质堆积形成坏死核心；而巨噬细胞分泌的基质金属蛋白酶也与斑块不稳定性相关。凝集素样氧化低密度脂蛋白受体-1(Lectin-like oxLDL receptor-1, LOX-1)在参与AS的细胞表面均有表达：LOX-1介导氧化低密度脂蛋白(Oxidized Low Density Lipoprotein, oxLDL)引发的内皮损伤及粘附分子表达,促进单核巨噬细胞与内皮的粘附,脂质的摄取及泡沫细胞的形成。许多病理因素可通过上调LOX-1的表达参与AS的发展。D-dimer是纤维蛋白降解产物,目前作为一个独立的临床指标用于疾病的诊断。血浆D-dimer水平可以指示AS的严重程度。基因芯片结果显示,D-dimer可上调巨噬细胞LOX-1表达,提示D-dimer可能参与AS。Nogo-B蛋白在血管重构过程中发挥引人注目的作用,也有研究表明该蛋白与AS相关。目的：研究D-dimer对巨噬细胞oxLDL受体LOX-1的表达,巨噬源性泡沫细胞的形成及其功能的影响。Nogo-B在巨噬源性泡沫细胞中的表达变化及其对泡沫细胞功能的影响。方法和结果：1.用D-dimer处理RAW264.7细胞,收集不同时间点的细胞提取总RNA及总蛋白,分别用Realtime PCR和Western blot方法测定样品中LOX-1 mRNA和蛋白表达。结果显示D-dimer对LOX-1的诱导作用呈时间依赖性,刺激12h后mRNA表达即上调,最大效应出现在24-36h,48h以后诱导作用减弱。LOX-1蛋白的表达则在24-48h最为明显。用不同浓度D-dimer与RAW264.7细胞共孵育,再测定LOX-1 mRNA和蛋白表达。结果显示D-dimer对LOX-1的诱导作用呈剂量依赖性,1μg/mL D-dimer即可诱导LOX-1的表达2.分别用D-dimer (2μg/mL), oxLDL(10μg/mL)与巨噬细胞共孵育48小时,然后用Western blot检测细胞中CD36的表达,结果显示该浓度的D-dimer不能上调CD36蛋白的表达,oxLDL也不能促使CD36表达显著升高。但将细胞先用相同浓度的D-dimer处理24h后再用oxLDL(10μg/mL)孵育24h,Western blot结果显示CD36蛋白表达较阴性对照组及oxLDL处理组均显著升高。3. D-dimer孵育巨噬细胞24h后用LOX-1的抗体封闭细胞表面受体,再用DiI-oxLDL刺激细胞,观察各组细胞荧光强度差异。结果显示,D-dimer处理组细胞的荧光强度与未处理组相比明显增强,而用LOX-1抗体处理细胞后,荧光强度下降。提示D-dimer可能通过诱导LOX-1表达促进巨噬细胞吞噬oxLDL,用oxLDL刺激预先用D-dimer处理过细胞,用Realtime PCR检测炎症因子TNF-α和IL-6的表达。结果显示：D-dimer可以增强oxLDL对炎症因子的诱导作用。4. D-dimer孵育巨噬细胞24h, Western blot检测细胞内组成型PKC蛋白的表达,结果显示D-dimer可增加该蛋白的表达。用PKC抑制剂预处理巨噬细胞,再用D-dimer孵育,Western blot检测细胞LOX-1蛋白的表达,结果表明用PKC抑制剂处理后,D-dimer对LOX-1表达的诱导作用减弱。5.用不同浓度DiI-oxLDL诱导巨噬细胞吞噬脂质形成泡沫细胞,以荧光强度指示脂质吞噬量。48h后将细胞裂解,Western blot检测泡沫细胞中Nogo-B的表达。各组荧光强度表明巨噬细胞对脂质的吞噬量与细胞外DiI-oxLDL浓度呈正比,Western blot结果显示泡沫细胞中Nogo-B蛋白表达增多,且低浓度oxLDL(≤10μg/mL)不能诱导Nogo-B蛋白的表达。6. Nogo-B的siRNA转染Raw264.7细胞,48h后检测细胞中Nogo-B蛋白的表达,结果显示siRNA可以有效降低巨噬细胞中Nogo-B蛋白的表达,沉默效率可达70%以上。用oxLDL刺激转染siRNA的巨噬细胞,Realtime PCR检测细胞因子TNF-α, IL-1β, IL-6的表达,结果显示：减少Nogo-B蛋白表达可以使泡沫细胞表达更多的促炎因子IL-1β,而对于TNF-α和1L-6没有明显影响。结论：D-dimer可以通过增加巨噬细胞中激活型PKC含量诱导巨噬细胞中LOX-1的表达,促进oxLDL的吞噬和炎症因子的表达,从而加速AS病程的发展。而Nogo-B蛋白在oxLDL诱导的巨噬细胞源性泡沫细胞中表达升高,并可能通过抑制炎症因子1L-1β的表达减缓AS的发展。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-10
缩略词表  10-11
前言  11-15
第一部分 D-dimer对巨噬细胞功能的影响  15-43
  一、实验材料和方法  15-30
  二、实验结果  30-41
  三、讨论  41-43
第二部分 Nogo-B对巨噬细胞功能影响的研究  43-55
  一、实验材料和方法  43-47
  二、实验结果  47-53
  三、讨论  53-55
结论  55-56
综述  56-60
参考文献  60-66
在读期间发表论文和参加科研情况  66-67
致谢  67

动脉粥样硬化过程中D-dimer和Nogo-B对巨噬细胞功能的影响

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