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牛隐孢子虫分子鉴定及防治抗体研究

作　者: 王昆
导　师: 张龙现
学　校: 河南农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 隐孢子虫水牛肉牛 PCR-RFLP C. andersoni 卵黄抗体制备
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

为了解河南省水牛和肉牛隐孢子虫的流行情况,对南阳南乐县肉牛和信阳鸡公山地区散养水牛进行了调查。粪便样品用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法进行检测,结果显示,水牛隐孢子虫感染率为16.73% (43/257),发现2种形态的隐孢子虫卵囊;肉牛隐孢子虫感染率为4.32% (9/208),只发现一种形态的隐孢子虫卵囊。对肉牛隐孢子虫分离株进行了遗传学特征分析,利用巢式PCR扩增出9个肉牛源隐孢子虫分离株18S rRNA基因序列片段,用限制性内切酶Ssp I和Vsp I对PCR产物进行消化酶切,结果9个分离株的酶切图谱和C. andersoni一致。随后的种系发育分析进一步证实了RFLP方法的结果。收集的上述牛安氏隐孢子虫以改进的Sheather’s蔗糖梯度离心法提纯卵囊,滤器滤过提纯,通过反复冻融和超声波处理制备颗粒性抗原,制备可溶性抗原,以弗氏完全和非完全佐剂制备免疫抗原,设定免疫程序,免疫开产健康母鸡。应用免疫抗原量梯度增加的免疫方法,取得了满意的抗体水平。颗粒性抗原组一免、二免抗原量分别为1×107个·只-1,1×107个·只-1,三免、四免抗原量均为1.5×107个·只-1,五免、六免抗原量均为2.5×107个·只-1,每次免疫间隔15～20d,共免6次。可溶性抗原组一免40μg·只-1,二免40μg·只-1,三免80μg·只-1,四免80μg·只-1,五免120μg·只-1,六免120μg·只-1,每次免疫间隔15～20d,共免6次。两个组母鸡免疫后卵黄抗体逐渐上升,在六免后15d,可溶性组卵黄抗体水平ELISA效价达到1:12800,峰值区域(1:12800～1:102400)持续12周左右;颗粒性组6免后45 d,卵黄抗体水平1:12800,其峰值区域(1:12800～1:51200)持续10周左右;卵黄抗体的消长趋势与血清抗体的基本一致,但血清抗体水平明显高于同期卵黄抗体水平。采用间接ELISA法对获得的卵黄抗体进行初步鉴定,其具有隐孢子虫属特异性。以水稀释-盐析法纯化本次实验获得的IgY抗体,经SDS-PAGE分析后,提纯后的IgY抗体,主要有2条蛋白条带,即68KD左右的重链,26KD左右的轻链。经Western-blotting分析,IgY抗体识别牛安氏隐孢子虫可溶性蛋白条带的分子量26KDa和68KDa。IgY抗体在65℃以下对活性无影响,70℃15 min后活性下降20%左右,75℃1 5 min,活性下降了80%左右,80℃15 min基本无活性。IgY在PH4～10时活性无明显变化,PH<3或>11时活性明显下降,具有良好的耐酸碱性。

全文目录

致谢  4-6
中文摘要  6-7
文献综述  7-18
  一我国牛隐孢子虫病研究进展  7-10
  二隐孢子虫病抗体治疗研究进展  10-18
试验一水牛隐孢子虫病流行病学调查  18-22
  1 材料与方法  18
  2 结论与分析  18-20
  3 分析与讨论  20-22
试验二肉牛隐孢子虫流行病学调查和分子鉴定  22-33
  1 材料与方法  22-25
  2 结果与分析  25-28
  3 讨论分析  28-33
试验三抗安氏隐孢子虫特异性卵黄抗体的制备与鉴定  33-52
  1 材料与方法  33-40
  2 结果与分析  40-48
  3 结论与讨论  48-52
参考文献  52-61
英文摘要  61-62

牛隐孢子虫分子鉴定及防治抗体研究

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