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金雀异黄素对雄性斑马鱼VTG的诱导及其机理研究

作　者: 陈洁
导　师: 王蔚；汝少国
学　校: 中国海洋大学
专　业: 生态学
关键词: 金雀异黄素斑马鱼 vtgmRNA ER 性激素 real-time PCR
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 54次
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内容摘要

金雀异黄素(Genistein,4’,5,7-三羟基异黄酮)是一种广泛存在于豆类植物中的异黄酮类植物雌激素,化学结构类似于17β-雌二醇(E2),是一种潜在的环境雌激素。目前金雀异黄素以较高浓度广泛地存在于鱼类饵料和环境水体中,使鱼类面临着食物和水体双重暴露的威胁。弄清金雀异黄素对鱼类的雌激素效应及其作用机理,对于发展水产养殖、保护渔业资源有着重要的理论和实际意义。雄鱼及幼鱼的卵黄原蛋白(VTG)作为一种公认的检测环境雌激素效应的生物标志物,曾被用于金雀异黄素对鱼类的雌激素效应的检测。目前,虽然有研究证实含金雀异黄素的饵料喂养能诱导雄鱼及幼鱼体内VTG的产生,但对其诱导机理却尚未进行深入研究。因此,本文验证了金雀异黄素水体暴露对雄性斑马鱼VTG的诱导效应,并从金雀异黄素影响雌激素受体表达及性激素水平变化的角度,初步研究了其对VTG的诱导机理。本实验采用1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L浓度的金雀异黄素对成年雄性斑马鱼进行水体暴露28天,通过real-time PCR技术检测雄鱼肝脏内Vtg1 mRNA的表达水平,验证水体中的金雀异黄素对鱼类VTG诱导的雌激素效应；在此基础上,通过检测雄性斑马鱼肝脏内ERαmRNA、ERβmRNA的表达水平,进一步研究了金雀异黄素在体内实验中对鱼类VTG诱导的选择性雌激素受体介导机制；并利用放射性免疫法检测了雄性斑马鱼性腺内睾酮和雌二醇水平的变化,探讨金雀异黄素是否通过影响性激素水平来实现对VTG的诱导。本文的研究结果表明：(1) 1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L的金雀异黄素水体暴露成熟雄性斑马鱼28天后,各处理组Vtgl mRNA的表达水平均上升,10μg／L和100μg／L浓度组出现了显著上升,高浓度组(1000μg/L)和E2对照组出现了极显著上升,并具有剂量效应关系,证实了金雀异黄素能够诱导鱼类VTG的产生。(2)与溶剂对照组相比,金雀异黄素处理组ERαmRNA的表达水平极显著降低,除低浓度组(1μg／L)外其他浓度组ERβmRNA的表达水平均出现了极显著上升；E2处理组两种ER基因的表达水平均极显著上升。证实了金雀异黄素对鱼类VTG基因的转录调节主要是通过ERβ来介导的,具有ERβ依赖性,推测这可能是金雀异黄素与ERβ的选择性结合及其结合力的大小所决定的。(3)除1μg/L和100μg/L浓度组外其他金雀异黄素处理组鱼体性腺内睾酮含量极显著下降,各处理组雌二醇含量均极显著上升。结果表明,金雀异黄素诱导斑马鱼肝脏内VTG产生的作用途径,一条是ERβ选择性介导途径,另一条则是通过直接提高雄鱼性腺内雌二醇的水平。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-11
0 前言  11-13
1 植物雌激素对鱼类生殖的影响及其作用机理的探讨  13-24
  1.1 植物雌激素的种类、来源及结构  13-14
  1.2 水体和饵料中的植物雌激素含量  14-16
  1.3 植物雌激素对鱼类生殖的影响  16-19
    1.3.1 对激素合成、代谢的影响  16
    1.3.2 对性别分化的影响  16-17
    1.3.3 对配子发生及性腺发育的影响  17
    1.3.4 对VTG合成的影响  17-18
    1.3.5 对胚胎发育的影响  18-19
  1.4 植物雌激素对鱼类生殖毒性的作用机制  19-23
    1.4.1 雌激素或抗雌激素作用  19
    1.4.2 雌激素受体(ER)介导途径  19-21
    1.4.3 非受体介导途径  21-23
  1.5 研究展望  23-24
2 金雀异黄素对雄性斑马鱼肝脏内VTG的诱导  24-35
  2.1 材料与方法  25-30
    2.1.1 实验动物  25
    2.1.2 实验药品与仪器  25-26
    2.1.3 实验方法  26-28
    2.1.4 Real-time PCR实验方法的建立  28-30
  2.2 结果与分析  30-32
    2.2.1 Real-time PCR产物的确定分析  30
    2.2.2 金雀异黄素对雄性斑马鱼肝脏内Vtg1 mRMA表达水平的影响  30-32
  2.3 讨论  32-34
  2.4 小结  34-35
3 金雀异黄素对雄性斑马鱼ERs基因表达的影响  35-44
  3.1 材料与方法  36-37
    3.1.1 实验材料  36
    3.1.2 主要药品和试剂  36
    3.1.3 主要实验仪器设备  36
    3.1.4 实验方法  36-37
    3.1.5 Real-time PCR方法  37
  3.2 结果与分析  37-40
    3.2.1 PCR产物的确定分析  37-39
    3.2.2 金雀异黄素对雄性斑马鱼肝脏ERα mRNA、ERβ mRNA表达水平的影响  39-40
  3.3 讨论  40-42
  3.4 小结  42-44
4 金雀异黄素对雄性斑马鱼性激素水平的影响  44-50
  4.1 材料与方法  44-46
    4.1.1 实验材料  44
    4.1.2 实验原理  44-45
    4.1.3 实验方法  45-46
    4.1.4 数据分析  46
  4.2 结果与分析  46-47
  4.3 讨论  47-49
  4.4 小结  49-50
5 结论  50-51
参考文献  51-61
致谢  61-62
个人简历  62
发表的学术论文  62

金雀异黄素对雄性斑马鱼VTG的诱导及其机理研究

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