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PKB/Akt在斑马鱼早期胚胎发育中的功能研究与分析

作　者: 谌爽
导　师: 李筠
学　校: 中国海洋大学
专　业: 生态学
关键词: 斑马鱼 PKBα/Aktl PKVγ/Akt3 过表达脑部发育神经保护
分类号: Q55
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

蛋白激酶B (Protein kinase B,PKB)也被称为Akt,是一种丝／苏氨酸激酶。它参与调节新陈代谢、细胞增殖、细胞存活以及细胞分化等重要的细胞生理活动。而且,PKB/Akt是IGF1重要的下游分子之一,预示着它在生长发育和胰岛素功能的调节中扮演着关键角色。在哺乳动物中,已经发现了PKB家族的三个成员,PKBα/Akt1,PKBβ/Akt2,PKBγ/Akt3。它们分别由不同的基因编码,但结构却十分保守。但据已有的研究结果分析,三者在活体内的功能有互补也有差异：Akt1删除导致小鼠新生死亡或者整体缩小；Akt2缺失会引发糖尿病；Akt3与出生后脑部尺寸有关。并且在敲除其中一种时,其余两者的表达水平未见明显升高,补偿作用也不明显,说明其功能具特异性。虽然PKB/Akt的研究已经十分广泛和深入,但是对该家族在早期胚胎发育中的功能还不明确。而且,小鼠的宫内发育模式,不便于早期发育的观察。所以我们利用斑马鱼胚胎体外发育、早期透明及便于基因操作等优势,围绕着PKB对早期胚胎发育的影响进行研究和分析。PKBa/Akt1是生物体内分布最广泛,也是研究得最多的PKB成员。目前在斑马鱼中,只克隆得到了akt2与akt2like,其功能及其他成员的研究尚未见报道。所以我们合成了持续激活的小鼠myr-Akt1 mRNA并注射到斑马鱼胚胎内过表达,观察并分析了akt1在早期发育过程中的作用。过表达后的表型分析显示,小鼠Akt1对早期胚胎的影响主要集中在脑部,表现为相对脑厚度和相对脑长度的显著增加,胚胎其他表型相对正常。用PI3K抑制剂LY294002抑制Akt激活后,可见脑部尺寸恢复到与对照组无差异的水平。在进一步分析了细胞增殖、细胞命运决定和细胞凋亡后发现,过表达myr-Akt1对细胞增殖没有影响,对细胞命运决定也没有影响,只是显著减少了脑部的自发性细胞凋亡,这可能是其增大脑部尺寸的方式之一。并且,我们还发现,过表达myr-Akt1在活体内对热激处理和UV照射处理引发的神经元凋亡具有抵抗作用,具有神经保护作用。这些结果是Akt1对早期胚胎发育影响的直接证据。并且说明PKBa/Akt1不仅对生物的整体生长发育调控有关,也对脑部的发育和大小有特异的影响。随后,我们采用RT-PCR和RACE相结合的方法,克隆得到了斑马鱼的pkby/akt3基因。其cDNA全长2874bp,编码479个氨基酸。斑马鱼Akt3具有Akt家族成员间保守的PH结构域、催化活性结构域和调节结构域以及两个保守的磷酸化位点Thr308和Ser473。与已发表的人、大鼠、小鼠等物种的Akt3氨基酸序列比较,相似性分别为95.8%、94.7%和95.4%。RT-PCR检测早期斑马鱼胚胎中akt3分布,发现在0-4hpf表达量较高,6-12hpf降低至较低水平,16hpf后表达量开始逐渐上升,至60hpf-96hpf则稳定在较高水平。原位杂交结果表明,akt3在2hpf至96hpf的胚胎都有表达,且没有组织特异性。在成鱼中,除鳃部外,Akt3在所检测的其余组织器官均有表达,在脑部和卵巢表达量较高；与Akt1研究相似的,我们构建并合成了斑马鱼myr-akt3 mRNA。过表达的结果显示,akt3能使斑马鱼胚胎的发育滞后且伴随着尾部短粗、体节模糊、尾末端膨大甚至严重缩短等不同程度畸形。而在斑马鱼myr-akt3注射组发育至24hpf时观察,排除akt3造成的发育延迟后,发现注射过akt3的斑马鱼胚胎的脑部厚度和长度较对照组显著增大,表明akt3对斑马鱼胚胎脑部尺寸发育有影响。综上所述,PKBα/Akt1,PKBγ/Akt3在斑马鱼早期胚胎发育中有相似的作用,两者都对脑部发育和尺寸形成有显著影响,而PKBγ/Akt3还会引起胚胎的发育滞缓及尾部的畸形。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-11
1 引言  11-27
  1.1 PKB/Akt简介  11-15
    1.1.1 PKB亚型和结构  11-13
    1.1.2 PKB的激活  13-15
    1.1.3 PKB的负调控  15
  1.2 PKB的生理功能  15-19
    1.2.1 PKB在细胞增殖过程中的功能  16-17
    1.2.2 PKB与糖原代谢平衡  17-18
    1.2.3 PKB与细胞存活  18-19
  1.3 PKB与疾病  19-22
    1.3.1 PKB与癌症  19-20
    1.3.2 PKB与Ⅱ型糖尿病  20-21
    1.3.3 PKB与神经疾病  21-22
  1.4 PKB亚型的功能研究  22-24
    1.4.1 PKBα/Akt1  22-23
    1.4.2 PKBβ/Akt2  23
    1.4.3 PKBγ/Akt3  23-24
  1.5 斑马鱼  24-25
  1.6 本研究的意义  25-27
    1.6.1 PKBα/Akt1  25-26
    1.6.2 PKBγ/Akt3  26-27
2 AKT1在斑马鱼中的功能研究  27-47
  2.1 前言  27-28
  2.2 材料与方法  28-36
    2.2.1 实验材料  28
    2.2.2 主要仪器  28
    2.2.3 主要化学和生物试剂  28-29
    2.2.4 实验方法  29-36
  2.3 实验结果  36-45
    2.3.1 myr-Akt1 mRNA在斑马鱼胚胎内的表达和活性验证  36-37
    2.3.2 myr-Akt1 mRNA使斑马鱼胚胎的脑部增大  37-38
    2.3.3 PI3K抑制剂处理使斑马鱼胚胎发育滞缓且脑部变小  38-40
    2.3.4 PI3K抑制剂处理减弱myr-Akt1注射使胚胎脑部增大的表型  40-41
    2.3.5 myr-Akt1影响脑部细胞凋亡但未改变脑部细胞的分化命运  41-43
    2.3.6 myr-Akt1保护脑部细胞不受热激及UV诱导的细胞凋亡  43-45
  2.4 讨论  45-47
3 斑马鱼akt3的克隆与表达谱分析及功能的初步研究  47-64
  3.1 前言  47-48
  3.2 材料与方法  48-52
    3.2.1 实验材料、主要仪器和试剂  48
    3.2.2 实验方法  48-52
  3.3 实验结果  52-62
    3.3.1 斑马鱼akt3的克隆与序列分析  52-55
    3.3.2 斑马鱼Akt3序列同源性以及进化树分析  55-56
    3.3.3 斑马鱼Akt3的时空表达谱分析  56-59
    3.3.4 斑马鱼Akt3过表达的表型分析和统计  59-62
  3.4 讨论  62-64
总结  64-66
展望  66-68
参考文献  68-74
致谢  74-76
个人简历  76
发表的学术论文  76

PKB/Akt在斑马鱼早期胚胎发育中的功能研究与分析

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