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核糖体大亚基蛋白L11的环状区loop62在调控蛋白质翻译中的作用

作　者: 张丹丹
导　师: 秦燕
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 生化与分子生物学
关键词: 蛋白质翻译 GAC L7/L12 L11 GTP 水解
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

在蛋白质翻译的过程中,能量产生于GTP 水解成GDP并释放无机Pi的过程。核糖体上存在一个GTPase-associated center( GAC)区域。GAC主要负责激活参与蛋白质翻译的GTP酶(translational GTPase,trGTPase)的GTP水解活性。GAC由三个重要的组件组成:23S rRNA上的sarcin-ricin loop (SRL),L10和L7/L12蛋白组成的stalk,23S rRNA的helix 43/44(H43/H44)及其结合的L11蛋白。L7/L12和L11的蛋白序列在原核生物中是高度保守的。L7/L12 stalk位于核糖体大亚基上,它由L10,L11和多拷贝的L7/L12组成。L7/L12在大肠杆菌中是4个拷贝数,它的N端结构域(NTD)锚定在23S rRNA上,并结合着L10。它的CTD伸展在核糖体的外面,招募trGTPase。L11蛋白由NTD和CTD组成,它的CTD结合在23S rRNA的H43/H44上,C端结构域(CTD)与NTD之间是一段柔性环状结构,它的NTD结构比较松散,可以在核糖体上来回摆动。trGTPase结合到核糖体上引起L11构象的改变,使得L11-NTD与GAC上L7/L12蛋白相互接触。L7/L12可以激活翻译因子的GTP酶活性,L11通过构象的改变像分子开关一样控制与L7/L12的相互作用,从而调节trGTPase的功能。本文主要研究L11-NTD loop62对GTP水解的影响以及在核糖体翻译过程中发挥的作用。L11-NTD的loop62位是一段非常短而且具有柔性的loop,它的功能非常重要,在空间位置上和L12-CTD靠的很近,它是L11与L12相互作用的部位。Loop62位包括4个氨基酸:Y(酪氨酸)、A(丙氨酸)、D(天冬氨酸)和R(精氨酸)。这几个氨基酸高度保守,尤其是天冬氨酸。我们对loop62位做了点突变,把酪氨酸、天冬氨酸和精氨酸分别突变成丙氨酸,把氨基酸的侧链突变掉,发现突变体重构的核糖体降低了GTP酶的GTP水解活性,同时体外翻译实验表明核糖体的体外翻译能力也下降了。Loop62一个氨基酸的微小变化影响了核糖体的功能,说明loop62在核糖体依赖性的GTP水解和蛋白质的翻译中都有一定的调控作用。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-8
第一章绪论  8-25
  1.1 蛋白质翻译过程中核糖体的功能  8-14
    1.1.1 核糖体的结构特点  8-10
    1.1.2 蛋白质翻译的全过程  10-14
  1.2 核糖体翻译过程中参与的蛋白因子  14-18
    1.2.1 起始因子IF1  14
    1.2.2 起始因子IF2  14
    1.2.3 延伸因子EF-TU 的结构特点  14-15
    1.2.4 延伸因子EF-G 的结构特点和功能  15-17
    1.2.5 释放因子RF3 的结构特点和功能  17-18
  1.3 GTP 水解相关中心（GTPase-associated center( GAC)）  18-23
    1.3.1 L7/L12 stalk  18-19
    1.3.2 L7/L12 的结构  19-20
    1.3.3 L10 的结构  20
    1.3.4 L11 的两个结构域和作用  20-23
  1.4 本课题研究的内容和意义  23-25
第二章材料和方法  25-43
  2.1 实验材料  25
    2.1.1 菌株和质粒  25
    2.1.2 试剂  25
  2.2 试验方法  25-43
    2.2.1 基因克隆  25-30
    2.2.2 重组蛋白在大肠杆菌中试表达  30-33
    2.2.3 蛋白的表达纯化  33-37
    2.2.4 L11 与L12 的相互作用研究  37-38
    2.2.5 缺失核糖体大亚基蛋白L11 的核糖体的提取  38-39
    2.2.6 缺失L11 核糖体的重构  39-40
    2.2.7 重构的L11 核糖体活性检测  40-42
    2.2.8 L11 基因敲除和补救实验  42-43
第三章实验结果  43-55
  3.1 L11 突变体的分子克隆  43-44
  3.2 L11 蛋白的试表达  44
  3.3 L11 和L11 突变体的纯化  44-47
  3.4 L12 蛋白和突变体的表达与纯化  47-51
  3.5 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）  51
  3.6 L11 与L12 的相互作用  51-52
  3.7 重构核糖体的活性检验  52-53
    3.7.1 GTPase（GTP 水解实验）  52
    3.7.2 体外翻译（RTS）实验  52-53
  3.8 L11 基因敲除和补救实验  53-55
第四章讨论  55-58
  4.1 L11loop62 位对于 GTP 水解活性的影响分子机制  55-56
  4.2 L11 对于核糖体翻译和细菌生长的影响  56-58
参考文献  58-61
致谢  61

核糖体大亚基蛋白L11的环状区loop62在调控蛋白质翻译中的作用

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