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产单核细胞李氏杆菌P60蛋白对全菌灭活苗免疫效力的增强作用研究

作　者: 周邦信
导　师: 才学鹏；曾巧英
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 产单核细胞李氏杆菌 P60蛋白 IL-4 IFN-γ 灭活苗免疫保护力
分类号: R392.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

产单核细胞李氏杆菌(Listeria monocytogenes,LM)是人畜共患的李氏杆菌病病原菌,引起脑膜炎、脑膜脑炎、流产及败血症等。P60蛋白是LM保护性免疫的重要抗原,P60遭到破坏是导致LM灭活苗保护力较低的原因之一。为增强LM灭活菌疫苗的免疫效力,本论文进行了以下几方面研究。1产单核细胞李氏杆菌入侵相关蛋白P60基因的克隆、表达及纯化。用PCR扩增LM 5782株iap基因,将其亚克隆至表达载体pET-30a,转化大肠杆菌BL21 (DE3),SDS-PAGE分析表明,表达的融合蛋白His-P60(简称P60)分子量约为46 ku,主要在上清中表达。Western-blot表明,P60可被LM全菌多抗识别,具有良好的反应原性。利用His标签亲和层析法纯化His-P60至电泳纯,分光光度计测定蛋白浓度为3.5mg/mL。2 P60对产单核细胞李氏杆菌灭活苗免疫增强作用的研究2.1 P60-LM灭活苗的免疫效力试验将电泳纯的P60(稀释至1mg/mL)与LM灭活菌(1010个/mL)混合,加Montanide ISA206佐剂1:1混合制备疫苗(P60-LM),背部皮下免疫BALB/c小鼠0.2 mL。初免后21 d同法进行二免,每隔7 d断尾采血,用间接ELISA检测抗体效价、MTT法检测淋巴细胞刺激指数、流式细胞术检测T淋巴细胞亚群比例、用Goat anti-mice ELISA检测试剂盒检测IL-4和IFN-γ的水平。二免21 d后,各组小鼠腹腔注射2×106 CFU/只(半数致死量)的LM活菌,48h后每组随机抽取10只小鼠,检测小鼠脾脏内的平均活菌数及细菌在小鼠体内的繁殖率。各组剩余的10只小鼠,记录2周内小鼠死亡数及死亡时间。同时,同法制备P60亚单位苗(P60蛋白1mg/mL)、LM灭活疫苗(1010个灭活菌/mL)及PBS空白对照组,此三个对照组以相同剂量相同程序进行平行免疫,并对比检测各项指标。结果表明,①一免后7 d开始,P60-LM灭活菌组的间接ELISA抗体效价均显著高于三个对照组(P<0.05),一免后14 d差异极显著(P<0.01);②二免后21 d, P60-LM灭活菌组(1.975±0.024)的淋巴细胞刺激指数显著高于LM灭活菌组(1.539±0.032)和PBS对照组(1.046±0.027)(P<0.05),分别增加了26.11%和78. 45%,但与P60组(1.899±0.053)比较差异不显著(P>0.05);③T淋巴细胞亚群分析表明,P60-LM灭活菌组小鼠CD3+和CD4+细胞比例均高于其他各组,其中CD4+细胞分别比LM灭活菌组、P60组和PBS对照组增加了31.51%、26.37%和44.66%,而CD8+细胞平均降低了11.36%、9.72%和38.64%,CD4+/CD8+细胞平均比值分别增加了22.89%、60.46%和18.67%;④一免后第7 d开始,除PBS对照组以外,其它各组IL-4水平逐步降低, P60-LM组和P60组与其他两组比较差异显著(P<0.05),除PBS对照组以外,其它各组IFN-γ水平差异不显著(P>0.05),但P60-LM组和P60组的IFN-γ/ IL-4比值升高,与其他各组比较差异显著(P<0.05);⑤攻毒保护试验表明,攻毒后7 d,P60-LM组小鼠全部存活,三个对照组均有小鼠死亡;攻毒后14 d存活率为:P60-LM组为9/10、LM组4/10、P60组6/10、PBS组0;攻毒后48 h小鼠脾脏内LM平均计数为:PBS组1.42×108CFU/ g,极显著高于其它三组(P<0.01),分别是P60-LM组、LM灭活菌组和P60组的194254.45、1392.16和118.33倍。2.2 P60-LLO-LM灭活苗对家兔的免疫效力试验用家兔进行P60-LLO-LM苗(P60蛋白1mg/mL+LLO蛋白0.3 mg/mL +1010个灭活菌/mL)、LM灭活菌和PBS空白苗的免疫试验,通过对各组家兔的抗体水平、IL-4和IFN-γ的含量变化以及发病情况,体内繁殖率的检测,证明P60和低剂量LLO能增强灭活疫苗的免疫保护效果,和BALB/c小鼠免疫试验的结果一致。结论:添加P60可刺激小鼠T淋巴细胞向CD4+的Th型方向分化,并增加淋巴细胞刺激指数,同时增强小鼠的体液免疫功能和细胞免疫功能;P60-LM苗和P60-LLO-LM苗的免疫保护力均显著高于LM灭活苗和P60亚单位苗。

全文目录

摘要  3-5
SUMMARY  5-9
前言  9-10
第一部分文献综述  10-22
  第一章产单核细胞李氏杆菌毒力因子及免疫预防研究进展  10-17
    1 毒力因子  10-14
    2 免疫预防  14-16
    3 展望  16-17
  第二章产单核细胞李氏杆菌检测方法研究进展  17-22
    1 实验室检测技术  17-21
    2 现阶段检测产单核细胞李氏杆菌存在的问题  21
    3 展望  21-22
第二部分研究报告  22-59
  第一章产单核细胞李氏杆菌P60 蛋白基因的克隆及表达  22-39
    1 材料与方法  22-32
    2 结果  32-36
    3. 讨论  36-39
  第二章 P60 蛋白对 LM 灭活苗免疫效力的增强效果研究  39-52
    1 材料与方法  39-41
    2 结果  41-49
    3 讨论  49-52
  第三章添加P60-LLO 蛋白对LM 灭活苗免疫效力的增强效果研究  52-59
    1 材料与方法  52-53
    2 结果  53-57
    3 讨论  57-59
结论  59-60
致谢  60-61
参考文献  61-69
附录一仪器与设备  69-70
附录二主要试剂与工具酶  70
附录三试剂配方  70-75
附录四英文缩略词表  75-77
附录五 P60 蛋白基因序列及编码氨基酸  77

产单核细胞李氏杆菌P60蛋白对全菌灭活苗免疫效力的增强作用研究

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