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人乳头瘤病毒18型类病毒颗粒疫苗研制、中和抗体筛选及冷冻电镜三维结构重建

作　者: 谢明辉
导　师: 夏宁邵
学　校: 厦门大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 大肠杆菌表达系统 人乳头瘤病毒18型 类病毒颗粒 冷冻电镜三维重建技术 中和抗体
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


高危型人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)病毒感染被认为是引起女性宫颈癌的主要原因。流行病学调查显示98%的宫颈癌都是由人乳头瘤病毒(HPV)感染引起,其中约70%是由HPV16或HPV18引起。因此,开发一种安全,有效的HPV18疫苗对于预防宫颈癌具有重大的意义。首先,本研究构建了高效HPV18L1蛋白大肠杆菌原核表达系统。利用该表达系统,HPV18 L1蛋白能够以可溶性形式表达,保留了其天然的表位。其次,本研究还还针对大肠杆菌来源的HPV18 L1蛋白建立了一套高效,易于放大的纯化工艺,以及类病毒颗粒体外组装工艺。根据该工艺所制备的HPV18VLPs疫苗纯度达到98%以上,各项鉴定指标均符合药典要求。且动物实验显示,该疫苗具有高度的免疫原性,在实验动物体能能诱导高滴度的HPV18中和抗体。本研究在成功制备HPV18 VLPs疫苗的基础上,利用假病毒中和模型,一共鉴定出HPV18中和单抗6株,而后通过阻断实验进一步确定了优势中和单抗11A9以及3C3。为了进一步阐明11A9单抗的中和机制,结合位点,在本研究对HPV18 VLPs进行了冷冻电镜观测,初步了解HPV 18 VLPs的结构模式。此外,还进一步制备了11A9-HPV18 VLPs抗原抗体复合物以备进一步进行冷冻电镜研究。总之,本研究利用大肠杆菌表达系统制备了一种廉价,有效的HPV18 VLP疫苗,对HPV18的中和单抗进行鉴定,并且对于HPV18优势单抗11A9的中和机制,结合位点进行了初步探索,为将来进行HPV18疫苗的分子设计提供了参考。

全文目录


目录  4-10
摘要  10-11
ABSTRACT  11-12
前言  12-36
  一、HPV病毒概述及研究进展  12-22
    1.1.HPV概述  12-13
    1.2.人乳头瘤病毒的分子生物学特点  13-20
      1.2.1.HPV的基因组及编码的蛋白  13-15
      1.2.2.HPV颗粒的主要形态结构  15-17
        1.2.2.1.HPV L1的主要抗原表位  16-17
        1.2.2.2.HPV L2的主要抗原表位  17
      1.2.3.HPV的感染和复制机制的研究  17-18
      1.2.4.人乳头瘤病毒引发的相关疾病  18-20
    1.3.HPV感染的分子生物学诊断  20-22
      1.3.1.HPV DNA检测  21
      1.3.2.HPV抗体检测  21-22
  二、乳头瘤病毒感染模型  22-26
    2.1.乳头瘤感染动物模型  22-23
    2.2.HPV组织培养模型  23-24
    2.3.转基因动物模型  24-25
    2.4.HPV假病毒感染模型  25-26
  三、人乳头瘤病毒疫苗的研究进展  26-31
    3.1.HPV治疗性疫苗  26-27
    3.2.HPV预防性疫苗  27-28
      3.2.1.类病毒颗粒(VLP)疫苗  27-28
    3.3.HPV预防性疫苗的研究现状  28-30
    3.4.疫苗研制中不同的表达体系  30-31
      3.4.1.真核表达系统  31
      3.4.2.原核表达系统  31
  四、生物大分子三维结构研究  31-34
    4.1.X射线晶体学  32
    4.2.核磁共振波谱学  32
    4.3.冷冻电镜与三维重构技术  32-33
    4.4.HPV农壳蛋白及二十面体对称性原理  33-34
  五、本研究的目的特点和意义  34-36
材料与方法  36-63
  1.仪器  36-37
  2.材料  37-42
    2.1.菌株、细胞株、质粒和引物  37
      2.1.1.大肠杆菌菌株  37
      2.1.2.质粒  37
      2.1.3.HPV18基因全长序列  37
      2.1.4.引物  37
      2.1.5.实验动物  37
    2.2.酶和单抗  37
    2.3.其他试剂  37-38
    2.4.常用溶液和培养基的配制  38-42
      2.4.1.LB培养基  38
      2.4.2.LB固体培养基  38
      2.4.3.氨苄青霉素储存液  38
      2.4.4.卡那霉素储备液  38
      2.4.5.选择性培养基  38
      2.4.6.碱法提取质粒溶液Ⅰ  38
      2.4.7.碱法提取质粒溶液Ⅱ  38
      2.4.8.碱法提取质粒溶液Ⅲ  38
      2.4.9.Tris—饱和酚  38-39
      2.4.10.酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)  39
      2.4.11.TE缓冲液  39
      2.4.12.50×TAE缓冲液  39
      2.4.13.DNA电泳凝胶加样缓冲液  39
      2.4.14.无DNA酶的RNA酶  39
      2.4.15.2×蛋白加样缓冲液  39
      2.4.16.PBS  39
      2.4.17.考马斯亮蓝染液  39
      2.4.18.裂解液  39
      2.4.19.蛋白SDS-PAGE试剂  39-40
        2.4.19.1.1.5 mol/L Tris-HCl(pH8.8)  39
        2.4.19.2.1.0 mol/L Tris-HCl(pH6.8)  39
        2.4.19.3.10%SDS  39-40
        2.4.19.4.10%过硫酸铵  40
      2.4.20.Western blot用试剂  40
        2.4.20.1.转移缓冲液  40
        2.4.20.2.TN洗涤液  40
        2.4.20.3.封闭液(WB用)  40
        2.4.20.4.TNT洗涤液  40
        2.4.20.5.HRP底物缓冲液  40
      2.4.21.EIA用试剂  40-41
        2.4.21.1.包被PB液  40
        2.4.21.2.封闭液(EIA用)  40
        2.4.21.3.PBST  40
        2.4.21.4.样品稀释液  40-41
        2.4.21.5.酶稀释液  41
        2.4.21.6.山羊标准血清  41
        2.4.21.7.兔抗羊HRP酶标抗体  41
        2.4.21.8.羊抗兔HRP酶标抗体  41
      2.4.22.单克隆抗体制备用试剂  41-42
        2.4.22.1.RPMI—1640培养液  41
        2.4.22.2.DMEM培养液  41
        2.4.22.3.HAT培养液  41
        2.4.22.4.HT培养液  41-42
        2.4.22.5.完全RPMI-1640液  42
  3.方法  42-63
    3.1.PCR扩增反应  42
    3.2.小量质粒快速提取  42-43
    3.3.酶切方法  43
    3.4.胶回收Kit回收片段  43
    3.5.乙醇沉淀法回收线性质粒  43-44
    3.6.连接反应  44
    3.7.E.coli感受态细胞的制备  44
    3.8.连接产物的转化  44
    3.9.质粒DNA的转化  44
    3.10.酶切鉴定  44-45
    3.11.工程菌的小量诱导表达  45
    3.12.工程菌的大量诱导表达  45
    3.13.高压均质机的使用  45-46
    3.14.利用切向流装置改变缓冲液体系  46
    3.15.SDS-聚丙烯胺凝胶电泳(SDS—PAGE)  46
    3.16.蛋白质免疫印迹法(Western Blotting)  46-47
    3.17.AKTA色谱纯化  47
    3.18.分子筛层析分析  47-48
    3.19.动态光散射实验  48
    3.20.重组蛋白的透射电镜观察  48
    3.21.计算机辅助分析与设计  48
    3.22.疫苗原液的检定规程  48-57
      3.22.1.蛋白质含量测定操作规程  48-50
      3.22.2.蛋白质分子量测定操作规程  50
      3.22.3.蛋白质纯度检定操作规程  50
      3.22.4.蛋白质纯度检定——高效液相色谱法检定操作规程  50-51
      3.22.5.宿主菌蛋白残留量测定操作规程  51-54
      3.22.7.细菌内毒素检查检定操作规程  54-56
      3.22.8.残余抗生素活性检查检定操作规程  56-57
      3.22.9.紫外光谱测定操作规程  57
    3.23.小鼠免疫实验和采血  57-58
    3.24.小鼠单克隆抗体的筛选  58-61
      3.24.1.脾细胞的选择  58
      3.24.2.饲养细胞的处理  58-59
      3.24.3.细胞融合  59-60
      3.24.4.抗体检测  60
      3.24.5.克隆化过程  60
      3.24.6.单克隆抗体的制备  60-61
      3.24.7.单克隆抗体的纯化  61
    3.25.小鼠中和抗体的鉴定(假病毒中和实验)  61-62
    3.26.中和抗体阻断实验  62-63
      3.26.1.EIA包板  62
      3.26.2.间接法EIA  62
      3.26.3.单抗阻断抗血清实验  62-63
结果与分析  63-108
  第一部分:HPV18疫苗的研制  63-96
    1.HPV高效表达载体的构建  63-65
      1.1.HPV18全基因组DNA的提取  63
      1.2.非融合表达载体pTO-T7-HPV18N65C-L1的构建  63-65
    2.HPV18L1纯化工艺的摸索及放大  65-78
      2.1.HPV18 L1的高密度发酵表达  65-66
      2.2.初纯工艺研究  66-70
        2.2.1.菌体破碎条件的摸索  66-68
        2.2.2.HPV18L1蛋白的硫酸铵沉淀纯化  68-69
        2.2.3.HPV-18 L1蛋白的硫铵沉淀吹溶条件的摸索  69-70
      2.3.HPV18 L1精纯条件的摸索  70-78
        2.3.1.刚离子交换层析  70
        2.3.2.层析介质选择  70-71
        2.3.3.样品上柱盐浓度的摸索  71-72
        2.3.4.不同pH条件下的纯化结果  72-73
        2.3.5.分步洗脱条件的确定  73-74
        2.3.6.工艺放大  74-75
        2.3.7.第二步柱层析  75-77
        2.3.8.工艺放大  77-78
    3.HPV18 L1类病毒颗粒组装条件摸索  78-81
      3.1.实验设计  79
      3.2.复性方法及结果  79-80
      3.3.不同复性速度的情况  80
      3.4.工艺放大及回收率  80-81
    4.HPV18疫苗原液检定  81-96
      4.1.无菌检查  81
      4.2.蛋白质含量  81-82
      4.3.分子量测定  82-83
      4.4.纯度  83-85
        4.4.1.电泳+免疫印迹法  83-84
        4.4.2.高效液相色谱(HPLC)  84-85
      4.5.鉴别试验  85-86
      4.6.抗原含量测定  86-87
      4.7.宿主菌蛋白残留量  87-88
      4.8.DNA残留量测定  88
      4.9.肽图分析  88-89
      4.10.紫外光谱测定  89-90
      4.11.N-末端氨基酸序列测定  90-91
      4.12.细菌内毒素检查  91
      4.13.二硫苏糖醇(DTT)残余量检查  91-92
      4.14.Tween-80含量测定  92
      4.15.HPV18疫苗免疫原性检定  92-96
        4.15.1.重组人乳头瘤病毒疫苗免疫BALB/c小鼠的半数有效剂量(ED50)和免疫持久性  93-94
          4.15.1.1.抗原间接法测定  93
          4.15.1.2.细胞中和实验  93-94
        4.15.2.HPV18疫苗对恒河猴的免疫原性  94-96
          4.15.2.1.ELISA检测  94-95
          4.15.2.2.假病毒中和实验法检测  95-96
  第二部分:HPV18中和单抗的鉴定  96-103
    1.中和抗体优势表位的鉴定  96-102
      1.1.HPV18单克隆抗体的筛选  96-98
      1.2.中和抗体的筛选  98
      1.3.优势中和抗体的筛选  98-102
        1.3.1.间接法ELISA  98-99
        1.3.2.单抗阻断山羊血清结合VLP实验  99-100
        1.3.3.单抗阻断兔血清结合VLP实验  100-101
        1.3.4.单抗互相阻断实验  101-102
    2.HPV18 VLP与中和抗体11A9抗原抗体复合物的制备  102-103
      2.1.单克隆抗体HPV18 VLP-11A9 Fab复合物的制备  102-103
        2.1.1.11A9 Fab的制备  102
        2.1.2.Fab-VLP复合物的制备  102-103
  第三部分 HPV18 VLP冷冻电镜三维结构重建  103-108
    3.1.HPV18 VLP三维结构立体几何分析  105-106
      3.1.1.HPV18 VLP的对称性  105
      3.1.2.HPV18 VLP手性分析  105-106
    3.2.HPV18 VLP的结构分析  106-108
讨论  108-117
  第一部分:HPV18 VLP疫苗的研制  108-112
    1.1.HPV18表达系统的确立  108-109
    1.2.HPV18纯化工艺的确立  109-110
    1.3.HPV18复性工艺的确立  110-111
    1.4.HPV18免疫保护性评价  111-112
  第二部分:优势中和表位的鉴定  112-114
    2.1.HPV18中和单抗的鉴定  112
    2.2.HPV18优势中和单抗的研究  112-114
      2.2.1.HPV18优势中和单抗的评价  112-114
      2.2.2.HPV18优势表位的鉴定  114
  第三部分、通过冷冻电镜及三维重建建立HPV18 VLP的三维模型  114-117
    3.1.HPV18 VLP三维结构分析  115
    3.2.解析精度的提高  115-117
小结与展望  117-118
参考文献  118-128
致谢  128

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